NAD⁺とNADHの測り分け操作

本キットに含まれる抽出バッファーと、除タンパク質用チューブを用いて簡便に培養細胞から細胞ライセートを調製できます。また細胞ライセートを加熱処理することで、細胞内 NADH量 のみを定量することができ、別途測定した総 NAD+/NADH 量からNADH 量を差し引くことで、細胞内 NAD+量を求めることができます。 本キットではn=3で12サンプルと標準サンプル8点の測定が可能です。12サンプル以上を使用する際には、別途フィルトレーションチューブをご準備頂く必要があります。

NAD⁺/NADH をマーカーとした研究

細胞内のNAD⁺とNADHの量は、薬剤投与や遺伝子組み換え等により影響を受けたガン細胞やミトコンドリア機能を理解する際の重要な代謝マーカーとして評価されています。最近では長寿に関わるサーチュインがNAD⁺量と深く関与していることが明らかとなっています。また肥満や糖尿病、細胞分化などの生物学的な状態を理解するためのマーカーとしても評価されるケースが増えています。

プレートアッセイで確かなデータ

本キット同梱の標準液を同時に測定することで、定量解析が行えます。サンプル中の総NAD⁺/NADH量が2 μmol/Lより濃い濃度の場合は、サンプルを希釈することで評価できます。下記の実験では、細胞数が2倍異なるHeLa細胞を用いて、NAD⁺とNADHの量と比を求めました。

増殖培地にて培養したHeLa細胞（2.5×10⁵、5.0×10⁵ cells) を用い、細胞内のNAD⁺量とNADH量を検量線から求めました。結果、NAD⁺量とNADH量は細胞数に応じた変化がみられ、またNAD⁺とNADHの量比は細胞数に変化があっても同等結果となりました。

乳酸測定キットと組合せた測定例

解糖系の阻害剤である2-Deoxy-D-glucoseをHeLa 細胞に加えた際の代謝活性の変化を確認しました。

HeLa細胞（1×10⁶ cells) に2-Deoxy-D-glucoseを最終濃度6 mmol/lになるよう添加し、24 時間培養後に乳酸量およびNAD⁺/NADH比を確認しました。乳酸測定は、培養上清を用いてLactate Assay Kit-WST（製品コード：L256）にて評価し、培養上清除去後の細胞を用いて本キットにてNAD⁺/NADH 比を評価しました。
結果、 2-Deoxy-D-glucose 添加により細胞内の解糖系が阻害されたことでLactate 量は減少し、NAD⁺/NADH 比は増加する結果が得られました。