05 細胞染色用色素

JC-1 MitoMP Detection Kit

JC-1 MitoMP Detection Kit

ミトコンドリア膜電位検出キット

  • 製品コード
    MT09  JC-1 MitoMP Detection Kit
容 量 本体価格
1 set ¥23,000
キット内容
1 set JC-1 Dye
Imaging Buffer (10x)
100 nmol x1
11 ml x1

性質

JC-1 MitoMP Detection Kitは、ミトコンドリア膜電位を測定できるキットです。従来、JC-1は染色溶液調製の際、溶けづらい等の課題がありますが、本キットは溶液調製方法によりそれを克服しております。さらに、本キットに含まれるImaging Bufferを用いることにより、蛍光バックグラウンドを抑えながら細胞にダメージを与えにくい状態で、細胞を観察することができます。
本キットは、従来よりミトコンドリア膜電位検出に使用されているJC-1色素と解析用のバッファーが含まれています。初めての方も使い易いよう、難溶性色素の溶解プロトコルをはじめ、様々なアプリケーションをご用意しています。

 

マニュアル

はじめての抗体標識プロトコル

死細胞数を測りたい(吸光測定)

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST を用いた細胞毒性試験の例を紹介

お役立ち情報

技術情報

なぜミトコンドリア膜電位が見られているか

ミトコンドリアは、ATP 等のエネルギー産生の場であり、その活性の変化や機能障害ががんや老化、神経変性疾患などと密接に関連しています。そのためミトコンドリアの状態を理解することが重要であり、その指標としてエネルギー産生に伴い生じる膜電位差が評価されています。
ミトコンドリアが正常で膜電位差が保たれた状態では、JC-1 が凝集し赤色の蛍光を発し、膜電位が低下すると、JC-1 が単量体として存在し緑色の蛍光を発します。この赤色と緑色の蛍光強度の変化をミトコンドリアの状態として評価することができます。

初めてでも使いやすい

従来の課題を解決

様々な装置に対応

解析時のバッファーを同梱

難溶性のJC-1 色素を容易に溶解することができます

検出装置毎に実験例を準備しています。

細胞の状態をより長く維持するため、HEPES 含有のバッファーを同梱しています。

脱分極による評価例

HeLa 細胞を脱分極剤であるcarbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone(FCCP)にて処理し、本キットで膜電位の変化を評価しました。
結果、未処理の細胞では、ミトコンドリア全体が赤く染まり、FCCP で処理した細胞は赤色蛍光の減少が確認されました。

 

 ■実験条件
JC-1 濃度 : 2 μmol/l in MEM, 染色時間 :30 min
FCCP 濃度 :100 μmol/l, FCCP 処理時間 :1 h


■検出条件
Green:Ex 488 nm / Em 500-550 nm
Red :Ex 561 nm / Em 560-610 nm
スケールバー:20 μm

操作の流れ

染色試薬を培養細胞へ添加するだけの簡単な操作で染色できます。また細胞の状態をより長く維持しながら解析できるHEPES 含有バッファーを本製品に同梱しています。

アポトーシス誘導時の評価例

下記、評価例の操作方法は、本品の取扱説明書にてご覧いただけます。

蛍光顕微鏡
アポトーシス誘導により変化した膜電位を色の変化で明瞭にイメージング

■検出条件
Green:Ex 488 nm / Em 500-550 nm
Red :Ex 561 nm / Em 560-610 nm
スケールバー:80 μm

フローサイトメーター
個々の細胞の膜電位変化を定量解析 (汎用のフィルターに対応)

■検出条件
Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm
Red :Ex 488 nm / Em 564-604 nm

プレートリーダー
ウェル中のすべての細胞を対象に膜電位の変化を確認 (多検体処理に対応)

■検出条件
Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm
Red :Ex 535 nm / Em 585-605 nm

マイトファジー誘導とミトコンドリア膜電位変化の検出

Parkin発現HeLa細胞を用いて、CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)添加の有無によるミトコンドリアの状態を、マイトファジー検出キット(Mitophagy Detection Kit:MD01)及びミトコンドリア膜電位検出キット(JC-1 MitoMP Detection Kit: MT09)にて評価しました。

結果、CCCP未処理の細胞ではマイトファジーは殆ど検出されず、またミトコンドリア膜電位が正常に維持されていることが確認されました。一方、CCCPを添加した細胞では、ミトコンドリア膜電位の低下(JC-1の赤色蛍光減少)とマイトファジーの誘導(Mtphagy Dyeの蛍光増大)を確認しました。


スケールバー:20 μm

<検出条件>
■マイトファジー検出
Ex: 561 nm, Em: 570-700 nm
■ミトコンドリア膜電位検出
Green Ex: 488 nm, Em: 500-550 nm
Red Ex: 561 nm, Em: 560-610 nm

<実験条件>
■HeLa細胞へのParkin プラスミドの導入
HilyMax(製品コード:H357)を用いてHeLa細胞へParkin プラスミドを導入(Parkin プラスミド/HilyMax reagent : 0.1 μg/0.2 μl)
し,一晩培養後の細胞を用いて下記検出を行った。

■マイトファジー検出
Parkin発現HeLa細胞に0.1 μmol/l Mtphagy working solution を添加し37 ℃で30分間インキュベートした。その後、細胞をHBSSにて洗浄し、10 μg/ml CCCP/MEM 溶液を添加し、37 ℃にて2時間インキュベートした。処理した細胞を、蛍光顕微鏡にて観察した。

■ミトコンドリア膜電位検出
Parkin発現HeLa細胞に10 μg/ml CCCP/MEM 溶液を添加し、37℃にて1.5時間インキュベートした。そこへ終濃度2 μmol/lとなるように4 μmol/l JC-1 working solutionを添加し、37 ℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、HBSSを用いて細胞を洗浄しImaging Buffer solutionを添加後、蛍光顕微鏡にて観察した。

ミトコンドリア膜電位と細胞周期との関連性

細胞周期のG2/M 期に作用して細胞増殖を停止させ、細胞老化を誘導することが知られているDoxorubicin(DOX) をA549 細胞へ添加後、Cell Cycle Assay Solution Blue (製品コード:C549)/ Deep Red(製品コード:C548)でA549 細胞における細胞周期の変化と、Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal(製品コード:SG03)で細胞老化、本製品でミトコンドリア膜電位の変化を確認しました。

技術や使用製品に関する補足

参考文献

参考文献を表示する

文献No. 対象サンプル 装置 引用(リンク)
1) 細胞
(U2OS, HeLa)
蛍光顕微鏡 T. Namba, "BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites ", Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
2) 細胞
(Neuron)
蛍光顕微鏡 I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , "Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons ", Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358.
3) 細胞
(3T3L1, C2C12)
プレートリーダー M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , "Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate ", Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
4) 細胞
(ALM)
プレートリーダー T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , "The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.", Cancer Discov, 2019, 9,
5) 細胞
(マクロファージ)
蛍光顕微鏡

G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, "A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages  massively deplete intracellular H2Oand produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis"  Biomaterials2020,  doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.

6) 細胞
(ARPE-19)
蛍光顕微鏡 J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M.  Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee,  "Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation"Int J Nanomedicine 2020, 15, 3695–3716.

 

よくある質問

Q

1キットあたりの使用回数の目安は?

A

目安となる使用回数の目安は、下記を参考にしてください。

* 容器毎で使用する液量によって使用回数は変わります。容器と液量を予め確認の上、ご使用ください。

 

Q

JC-1染色後の細胞の洗浄には、HBSSの代わりにPBSを使用できますか?

A

細胞へのダメージを軽減するため、HBSSの使用を推奨しております。HBSSがお手元にない場合は培地での洗浄を推奨します。

Q

血清入り培地を使用してもいいですか?

A

細胞洗浄やWorking Solutionに血清入り培地を使用して頂いて構いません。蛍光観察時はImaging Bufferを推奨しますが、血清入り培地をご使用の場合はフェノールレッド不含培地を推奨します。

Q

染色後の細胞固定化、または細胞固定化後の染色は可能ですか?

A

固定化によりミトコンドリアが脱分極するため、染色後の固定及び固定化後の染色は出来ません。

Q

薬剤処理したサンプルをコントロールと比較したところ、赤と緑の両方の蛍光値が増加(又は減少)しました。 結果をどのように解釈すればよいのでしょうか?

A

赤色と緑色の蛍光比を比較してください。
薬剤処理サンプルとコントロールの各々で赤色蛍光値/緑色蛍光値の比を算出してください。
両者を比較して蛍光比が低い程ミトコンドリア膜電位が低下していると考えられます。

(赤/緑の比で評価する理由)
JC-1は膜電位依存的に細胞に蓄積するため、細胞の状態により細胞あたりのJC-1の濃度は異なる場合があります1)2)。(コントロールと薬剤処理サンプルでは細胞の状態が異なるため、JC-1の蓄積濃度が異なります。)
また、JC-1はミトコンドリア膜電位が高い状態では凝集し緑から赤色に蛍光がシフトします。この凝集体の量は膜電位の程度に依存する3)ことから、赤/緑の比でサンプル間のミトコンドリア膜電位を比較することができます。

<参考文献>
1)    Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.
2)    Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430
3)    Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci.1991, 88, 3671. 

取扱条件

取扱条件
1.安衛法, 2.保存方法:冷蔵

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