05 細胞染色用色素

mtSOX Deep Red - Mitochondrial Superoxide Detection

mtSOX Deep Red - Mitochondrial Superoxide Detection

ミトコンドリア スーパーオキサイド検出用蛍光色素

  • ミトコンドリアスーパーオキサイドを長波長励起(Deep Red)で検出可能
  • 緑色や赤色の蛍光色素と共染色が可能
  • スーパーオキサイドとの選択性が高い
  • 製品コード
    MT14  mtSOX Deep Red - Mitochondrial Superoxide Detection
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
100 nmol ¥20,000 348-09851

性質

ミトコンドリアでは ATP を合成する際に活性酸素種の一つであるスーパーオキサイドが発生しています。 正常な状態の細胞であれば、抗酸化能が働き発生した活性酸素を無毒化しますが、ミトコンドリア機能異常が起こると活性酸素が過剰に発生 し、細胞に様々な機能不全を引き起こします。このような細胞の酸化ストレスを議論する際に、細胞内の活性酸素やミトコンドリア膜電位とミトコンドリアの活性酸素を同時解析するニーズが増えてきております。
 mtSOX Deep Redはミトコンドリア内のスーパーオキサイドと選択的に反応し、さらに既存品よりも長波長の蛍光を発するため、困難であった緑や赤色の蛍光特性を持つミトコンドリア膜電位検出色素等との共染色が可能です。

技術情報

既存試薬との比較

活性酸素種に対する反応選択性

mtSOX Deep Redと既存品(T社)の各活性酸素種(ROS)に対する反応性を比較しました。既存品と比べてmtSOX Deep Redはスーパーオキサイド選択性が高いことが確認されました。

また、mtSOX Deep Redは既存品よりも長波長の蛍光を発するため、これまで困難であったミトコンドリア膜電位染色色素(JC-1色素MT09, TMRE, MT-1色素MT13)との共染色が可能です。

 

実験例:ミトコンドリアスーパーオキサイドと膜電位の同時測定

HeLa細胞をHBSSにて洗浄後、mtSOX Deep Redと小社ミトコンドリア膜電位染色色素(JC-1 : 製品コードMT09もしくはMT-1: 製品コードMT13)を用いて共染色し、発生したミトコンドリアROSと膜電位を同時に観察しました。
その結果、いずれの条件でもミトコンドリアROSの発生に伴うミトコンドリア膜電位の低下を同時に観察することが出来ました。

<JC-1を用いた実験操作>


検出条件(共焦点レーザー蛍光顕微鏡)
JC-1 :緑 Ex = 488, Em = 490-520 nm, 赤 Ex = 561, Em = 560-600 nm
mtSOX :Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
スケールバー:10 µm

検出条件(マイクロプレートリーダー)Tecan, Infinite M200 Pro
JC-1 :緑 Ex = 480-490 nm, Em = 525-545 nm, 赤 Ex = 530-540 nm, Em = 585-605 nm
mtSOX :Ex = 545-555 nm, Em = 665-685 nm

<MT-1を用いた実験操作>


検出条件(共焦点レーザー蛍光顕微鏡)
MT-1: Ex = 561, Em = 560-600 nm
mtSOX: Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
スケールバー:10 µm

検出条件(マイクロプレートリーダー)Tecan, Infinite M200 Pro
MT-1: Ex = 540-550 nm, Em = 590-610 nm (Gain = 200)
mtSOX :Ex = 545-555 nm, Em = 665-685 nm

実験例:細胞内Total ROSとミトコンドリアスーパーオキサイドの同時測定

HeLa細胞をHBSSにて洗浄後、mtSOX Deep Redと小社細胞内ROS検出色素(ROS Assay Kit –Highly Sensitive DCFH-DA-:製品コード R252)を用いて共染色し、ミトコンドリアスーパーオキサイド発生剤(Antimycin)もしくは過酸化水素による異なる刺激を誘導し、観察を行いました。

その結果、細胞全体でのROS 誘導とミトコンドリア由来の ROS誘導を見分けることが観察できました。

実験操作

過酸化水素刺激の結果

Antimycin刺激の結果

検出条件(共焦点レーザー蛍光顕微鏡)
細胞内 ROS: Ex = 488, Em = 490-520 nm
mtSOX :Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm
スケールバー:10 µm

実験例:ミトコンドリア量、ミトコンドリア膜電位、ミトコンドリアスーパーオキサイドの同時解析

核染色試薬(Hoechst33342: 製品コードH342)とミトコンドリア量検出色素(MitoTrackerTM Green FM)、ミトコンドリア膜電位検出色素(Tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE))を用いて染色したHeLa細胞をHBSSにて洗浄後、Antimycinを含むmtSOX Deep Red working solutionを用いて染色し、発生したミトコンドリアROSと膜電位、ミトコンドリア量、核を同時に観察しました。
 その結果、ミトコンドリア量の変化が無い状態で、ミトコンドリアROSの発生に伴うミトコンドリア膜電位の低下を同時に観察することが出来ました。

<検出条件>
検出器:共焦点レーザー顕微鏡
(青)核:Hoechst33342 (Ex = 405 nm, Em = 450-495 nm)
(緑)ミトコンドリア量:MitoTrackerTM Green FM (Ex = 488 nm, Em = 500-550 nm)
(赤)ミトコンドリア膜電位:TMRE (Ex = 561 nm, Em = 560-620 nm)
(紫)ミトコンドリアスーパーオキサイド:mtSOX Deep Red (Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm)

スケールバー:10 µm

使用回数の目安

測定可能なサンプル数は以下をご参考ください。
・96-well plate: 1枚
・ibidi 8-well plate: 6枚
・35 mm dish: 5枚

蛍光特性

参考文献

参考文献を表示する

 
文献No. 対象サンプル 装置    引用(リンク)
1) 細胞
(ラット腎近位尿細管細胞)
蛍光顕微鏡 D. Sun, S. Cui, H. Ma, P. Zhu, N. Li, X. Zhang, L. Zhang, L. Xuan, J. Li , "Salvianolate ameliorates renal tubular injury through the Keap1/Nrf2/ARE pathway in mouse kidney ischemia-reperfusion injury", 2022J. Ethnopharmacol., doi:10.1016/j.jep.2022.115331.
2) 細胞
TIG-1 Cell (老化研究用) ヒト胎児肺由来線維芽細胞
蛍光顕微鏡 Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, "Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts", 2022, doi:10.1016/j.exger.2022.111866.

 

よくある質問

Q

mtSOX Deep Redの検出原理を教えてください。

A

mtSOX Deep Redはスーパーオキシド選択的に酸化され発蛍光する色素です。
さらに、本色素は膜電位依存的に細胞内のミトコンドリアに局在するため、ミトコンドリアのスーパーオキシドを特異的に検出することができます。
スーパーオキシド誘導に伴いミトコンドリアの膜電位が消失する場合、反応後の色素は核小体や細胞質に分散します。

Q

培地以外でWorking solutionの調製は可能ですか?

A

可能です。培地以外でしたらHBSSやPBSをご使用いただけます。

Q

検出可能な検出器と適切なフィルターを教えてください。

A

共焦点レーザー顕微鏡、落射型蛍光顕微鏡、プレートリーダーで検出可能です。

・共焦点レーザー顕微鏡
Ex/Em: 561/640-700 nm (赤色色素と共染色しない場合)
Ex/Em: 633/640-700 nm (赤色色素と共染色する場合)

・落射型蛍光顕微鏡
TxRedフィルター
Ex/Em: 540-580/590-670 nm 

・プレートリーダー
Ex/Em: 535–565/660–690 nm

Q

刺激後の染色は可能ですか?

A

ミトコンドリア膜電位が低下しない条件であれば可能です。
本色素は膜電位依存的にミトコンドリアに集積します。そのため刺激により膜電位が低下する場合は、刺激後の染色ではミトコンドリアに集積できず正確なスーパーオキシドの検出ができません。
上記特徴から、小社では刺激前染色を推奨しております。

取扱条件

規格
性状: 白色~淡紫色固体
確認試験: 試験適合
含量: 試験適合
取扱条件
1.保存方法:冷蔵
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