これからはじめるバイオセンサー

バイオセンサーとは

バイオセンサーは、生物学的な素材（酵素、抗体、核酸、微生物など）を用いてターゲットとなる物質を検出し、電気化学や光学的なトランスデューサーによって信号化することで、ターゲット物質を選択的かつ高感度に定量することができる検出装置です。そのためバイオセンサーは、臨床診断、創薬、食品分析、環境調査など幅広い分野での応用が期待されています。

【関連論文】
・バイオセンサー入門 (Review)
Nikhil Bhalla, Pawan Jolly, Nello Formisano, and Pedro Estrela, Introduction to biosensors, Essays Biochem., 2016, 60(1), 1.

・電気化学バイオセンサー：原理と構造（Review）
Dorothee Grieshaber, Robert MacKenzie, Janos Vörös, Erik Reimhult, Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures, Sensors, 2008, 8(3), 1400.

検出法および原理

バイオレセプター（Bioreceptor）とは、ターゲット物質を認識する生物学的な素材を指します。バイオレセプターは、ターゲット物質を選択的に認識するために重要なコンポーネントであり、酵素、抗体、細胞、アプタマー、核酸などが使われています。

トランスデューサー（Transducer）とは、あるエネルギーを別のエネルギーに変換する素子のことです。バイオセンサーにおけるトランスデューサーの役割は、生体認識した信号を測定可能な信号に変換することにあり、分析物に対してバイオレセプターが相互作用した量と、光学的または電気的に生成した信号が比例関係にある必要があります。

＜光学的信号＞
光学的な信号を用いたセンサーとして、表面プラズモン共鳴（SPR）ベースのバイオセンサーが広く使われていますが、他にもエバネッセント波蛍光や生物発光光ファイバーバイオセンサー、表面増強ラマン散乱バイオセンサーなど、様々なバイオセンサーシステムが研究されています。

＜電気化学信号＞
金属電極や炭素電極の表面にバイオレセプターを修飾し生成した電気化学バイオセンサーが一般的に知られています。出力信号は、電極表面のバイオレセプターがターゲット物質と結合または触媒反応により生成され、電気化学信号による装置はコンパクトかつ軽量化できる点で注目されています。

アンプリファイアー（Amplifier）とは、トランスデューサーにより変換された信号を処理し、数値化した情報を表示する部分です。複雑な電子回路で構成され、信号の増幅やアナログからデジタルへの変換など信号の調整も担います。バイオセンサーの結果を数値やグラフなどを用いて容易に判断できるような表示が求められ、ハードウェアとソフトウェアを組み合わせた開発が進められています。

バイオセンサーへの固定化法

バイオセンサーを作製する際には、基板に固定化する「レセプター等」の選択とそれらの「固定化法」の選択が感度や特異性を決定する非常に重要な因子となります。同仁化学研究所では「固定化法」で利用できる、SAM試薬、二価性試薬(クロスリンカー)、活性化試薬、ビオチン化試薬などを販売しており、バイオセンサー開発にご活用頂いています。更に酵素活性の安定性や感度に大きく関与する電子メディエーターを基盤や酵素に直接標識可能な試薬も開発しています。また生体イオン測定における「レセプター」となる各種イオノフォア類もお取り扱いしています。

SAM試薬～チオール誘導体
固体表面に結合、集積し、自発的にナノレベルの薄膜を形成する自己組織化単分子膜(Self-Asssembled Monolayer; SAM)は、その作製の簡便さと、用途の広さから、近年盛んに研究されています。チオールやジスルフィドの誘導体は金、銀、銅、パラジウム、白金等の貴金属表面に高密度なSAMを形成することが知られており、特に金基板上のSAMは、SPRやQCM等のバイオセンサ、金ナノ粒子の機能化、電子材料への応用など様々な用途で使用されています。

SAM試薬～チオール誘導体

固体表面に結合、集積し、自発的にナノレベルの薄膜を形成する自己組織化単分子膜(Self-Asssembled Monolayer; SAM)は、その作製の簡便さと、用途の広さから、近年盛んに研究されています。チオールやジスルフィドの誘導体は金、銀、銅、パラジウム、白金等の貴金属表面に高密度なSAMを形成することが知られており、特に金基板上のSAMは、SPRやQCM等のバイオセンサ、金ナノ粒子の機能化、電子材料への応用など様々な用途で使用されています。

カルボン酸活性化試薬、二価性試薬、NTA誘導体
基板にタンパク質を固定化する際に最も良く用いられるのは、基板上のカルボン酸をWSC(EDC)/NHSで活性化し、タンパク質のアミノ基と反応してアミド結合で固定化する方法です。WSCは水溶性で、洗浄が容易な活性化剤です。WSCとNHSを小分けし、活性化や固定化に必要な緩衝液等をセットにしたAmine Coupling Kitもご用意しております。SH基を有する分子を基板に固定化する際には二価性試薬が良く用いられます。アミノ基を有する基板と二価性試薬を反応して基板にSH反応性のマレイミド基を導入します。His-Tagを導入したタンパク質の固定化にはNi-NTA錯体が有用です。小社ではカルボン酸表面に固定可能なAB-NTAや、アミノ基と反応性のイソチオシアネートを有するIsothiocyanobenzyl-NTA、SH基と反応性のマレイミド基を有するMaleimido-C3-NTAなどを取り扱っています。

カルボン酸活性化試薬、二価性試薬、NTA誘導体

基板にタンパク質を固定化する際に最も良く用いられるのは、基板上のカルボン酸をWSC(EDC)/NHSで活性化し、タンパク質のアミノ基と反応してアミド結合で固定化する方法です。WSCは水溶性で、洗浄が容易な活性化剤です。WSCとNHSを小分けし、活性化や固定化に必要な緩衝液等をセットにしたAmine Coupling Kitもご用意しております。SH基を有する分子を基板に固定化する際には二価性試薬が良く用いられます。アミノ基を有する基板と二価性試薬を反応して基板にSH反応性のマレイミド基を導入します。His-Tagを導入したタンパク質の固定化にはNi-NTA錯体が有用です。小社ではカルボン酸表面に固定可能なAB-NTAや、アミノ基と反応性のイソチオシアネートを有するIsothiocyanobenzyl-NTA、SH基と反応性のマレイミド基を有するMaleimido-C3-NTAなどを取り扱っています。

ビオチン化試薬及びキット
ビオチンはアビジン類と強く結合することが知られており、その性質を利用してバイオセンサに広く利用されています。タンパク質等のアミノ基にビオチンを導入する際には活性エステル基を持つビオチンが、SH基が対象の場合はマレイミド基を持つビオチンが、アルデヒドが対象の場合はヒドラジド基を有するビオチン化試薬が用いられます。小社では抗体標識に適したビオチン化キット(アミノ基またはSH基用）も販売しています。Biotin-SS Sulfo-OSuはビオチン標識後に還元してSS結合を切断することが可能なビオチン化試薬です。タンパク質を標識後、アビジンカラムでトラップし、SSを切断してアビジンカラムからタンパク質を溶出させるといった使い方が可能です。

ビオチン化試薬及びキット

ビオチンはアビジン類と強く結合することが知られており、その性質を利用してバイオセンサに広く利用されています。タンパク質等のアミノ基にビオチンを導入する際には活性エステル基を持つビオチンが、SH基が対象の場合はマレイミド基を持つビオチンが、アルデヒドが対象の場合はヒドラジド基を有するビオチン化試薬が用いられます。小社では抗体標識に適したビオチン化キット(アミノ基またはSH基用）も販売しています。Biotin-SS Sulfo-OSuはビオチン標識後に還元してSS結合を切断することが可能なビオチン化試薬です。タンパク質を標識後、アビジンカラムでトラップし、SSを切断してアビジンカラムからタンパク質を溶出させるといった使い方が可能です。

電子メディエーター
脱水素酵素とその基質検出に有用な電子メディエーターとして、1-Methoxy-PMSは広く使用されるようになってきましたが、更に溶液状態での安定性を高めた1-Methoxy PESを開発しました。更に、バイオセンサー分野でも応用可能にするため、酵素や基盤に標識可能なAmine-reactive PESを開発いたしました。更にPMSやPESだけでなくご希望の電位に即したメディエーターを開発しておりますので、ご希望の方は小社までご連絡ください。

電子メディエーター

脱水素酵素とその基質検出に有用な電子メディエーターとして、1-Methoxy-PMSは広く使用されるようになってきましたが、更に溶液状態での安定性を高めた1-Methoxy PESを開発しました。更に、バイオセンサー分野でも応用可能にするため、酵素や基盤に標識可能なAmine-reactive PESを開発いたしました。更にPMSやPESだけでなくご希望の電位に即したメディエーターを開発しておりますので、ご希望の方は小社までご連絡ください。

バイオセンサー研究の報告例

検出対象	バイオレセプター	トランスデューサー	使用試薬	参考論文
複数の生体分子	DNA/Protein Microarrays	SPR imaging	AB-NTA	T. Seefeld, A. Halpern, and R. Corn, On-Chip Synthesis of Protein Microarrays from DNA Microarrays Via Coupled In Vitro Transcription and Translation for Surface Plasmon Resonance Imaging Biosensor Applications, J. Am. Chem. Soc., 2012, 134(30), 12358.
特定タンパク質	RNA aptamer	SPR imaging	11-Amino-1-undecanethiol, hydrochloride	Y. Li, H. Lee, and R. Corn, Fabrication and characterization of RNA aptamer microarrays for the study of protein–aptamer interactions with SPR imaging. Nucleic Acids Res. 2006, 34, 6416.
anti-SARS-CoV-2抗体	蛍光標識抗体	蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）	HiLyte Fluor™ 647 Labeling Kit-NH₂	K. Nishiyama, K. Takahashi, M. Fukuyama, M. Kasuya, A. Imai, T. Usukura, N. Maishi, M. Maeki, A. Ishida, H. Tani, K. Hida, K. Shigemura, A. Hibara, and M. Tokeshi, Biosens Bioelectron, Facile and rapid detection of SARS-CoV-2 antibody based on a noncompetitive fluorescence polarization immunoassay in human serum samples., Biosens Bioelectron., 2021, 190, 113414.
ヒトパピローマウイルス（HPV）	POD標識抗体 Biotin標識抗体	ELISA	Peroxidase Labeling Kit - NH₂ Biotin Labeling Kit - NH₂	R. Hu, Z. Dong, K. Zhang, G. Pan, C. Li, and H. Cui, Preparation, Characterization and Diagnostic Valuation of Two Novel Anti-HPV16 E7 Oncoprotein Monoclonal Antibodies, Viruses, 2020, 12, 333.
血清クレアチニン	HRP標識抗体	gold electrode chips	Biotin Labeling Kit - NH₂	F. Wei, S. Cheng, Y. Korin, E. Reed, D. Gjertson, C. Ho, H. Gritsch, and J. Veale, Serum Creatinine Detection by a Conducting Polymer Based Electrochemical Sensor to Identify Allograft Dysfunction, Anal. Chem., 2012, 84, 7933.
血糖値（2.5世代グルコースセンサー）	PES修飾FAD-GDH	電極	Amine-reactive PES	M. Hatada, N. Loew, Y. Inose-Takahashi, J. Okuda-Shimazaki, W. Tsugawa, A. Mulchandani, K. Sode, Development of a glucose sensor employing quick and easy modification method with mediator for altering electron acceptor preference, Bioelectrochemistry, 2018, 121, 185.
血糖値（2.5世代グルコースセンサー）	PES修飾GOx	電極	Amine-reactive PES	N. Suzuki, J. Lee, N. Loew, Y. Takahashi-Inose, J. Okuda-Shimazaki, K. Kojima, K. Mori, W. Tsugawa and K. Sode, Engineered Glucose Oxidase Capable of Quasi-Direct Electron Transfer after a Quick-and-Easy Modification with a Mediator, Int. J. Mol. Sci., 2020, 21, 1137.
乳酸	PES修飾 L-lactate oxidase (LOx)	電極	Amine-reactive PES ※アスコルビン酸、アセトアミノフェンの添加影響を確認	K. Hiraka, K. Kojima, W. Tsugawa, R. Asano, K. Ikebukuro, and K. Sode, Rational engineering of Aerococcus viridans l-lactate oxidase for the mediator modification to achieve quasi-direct electron transfer type lactate sensor, Biosensors and Bioelectronics, 2020, 151, 111974.
HbA1c	PES修飾fructosyl peptide oxidase (FPOx)	フローインジェクション分析	Amine-reactive PES	M. Hatada, S. Saito, S. Yonehara, W. Tsugawa, R. Asano, K. Ikebukuro, and K. Sode, Development of glycated peptide enzyme sensor based flow injection analysis system for haemoglobin A1c monitoring using quasi-direct electron transfer type engineered fructosyl peptide oxidase. Biosensors and Bioelectronics, 2021, 177, 112984.
L-glutamine	PES修飾L-glutamine-binding protein (QBP)	電極	Amine-reactive PES	S. Takamatsu, J. Lee, R. Asano, W. Tsugawa, K. Ikebukuro, and K. Sode, Continuous electrochemical monitoring of L-glutamine using redox-probe-modified L-glutamine-binding protein based on intermittent pulse amperometry, Sensors and Actuators B: Chemical, 2021, 346, 130554.

お役立ち情報

ウェアラブル【論文】
無細胞系で比色または光ファイバーによる検出を利用し、SARS-CoV-2を室温で90分以内に検出を可能にしたウェアラブルデバイスの報告。 P. Nguyen, L. Soenksen, N. Donghia, N. Angenent-Mari, H. Puig, A. Huang, R. Lee, S. Slomovic, T. Galbersanini, G. Lansberry, H. Sallum, E. Zhao, J. Niemi & J. Collins, Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection, Nature Biotechnology, 2021, 39, 1366.

ウェアラブル【論文】

無細胞系で比色または光ファイバーによる検出を利用し、SARS-CoV-2を室温で90分以内に検出を可能にしたウェアラブルデバイスの報告。
P. Nguyen, L. Soenksen, N. Donghia, N. Angenent-Mari, H. Puig, A. Huang, R. Lee, S. Slomovic, T. Galbersanini, G. Lansberry, H. Sallum, E. Zhao, J. Niemi & J. Collins, Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection, Nature Biotechnology, 2021, 39, 1366.

グルコースセンサー【論文：レビュー】
既に商業化されているグルコースバイオセンサーの歴史および学術的観点からレビュー。金ナノ粒子、カーボンナノチューブ、カーボン/グラフェン量子ドット、キトサンハイドロゲル複合体などについても概説。 V. Juska and M. Pemble, A Critical Review of Electrochemical Glucose Sensing: Evolution of Biosensor Platforms Based on Advanced Nanosystems, Sensors, 2020, 20, 6013.

グルコースセンサー【論文：レビュー】

既に商業化されているグルコースバイオセンサーの歴史および学術的観点からレビュー。金ナノ粒子、カーボンナノチューブ、カーボン/グラフェン量子ドット、キトサンハイドロゲル複合体などについても概説。
V. Juska and M. Pemble, A Critical Review of Electrochemical Glucose Sensing: Evolution of Biosensor Platforms Based on Advanced Nanosystems, Sensors, 2020, 20, 6013.

外耳道センサー【論文】
皮膚から放出される経皮ガスの検出の際、発汗等による測定部位の特定が求められている。本報告では外耳での検出が血中VOCを指標としたモニタリングに適していることを報告。 K. Toma, S. Suzuki, T. Arakawa, Y. Iwasaki & K. Mitsubayashi, External ears for non-invasive and stable monitoring of volatile organic compounds in human blood, Scientific Reports, 2021, 11, 10415.

外耳道センサー【論文】

皮膚から放出される経皮ガスの検出の際、発汗等による測定部位の特定が求められている。本報告では外耳での検出が血中VOCを指標としたモニタリングに適していることを報告。
K. Toma, S. Suzuki, T. Arakawa, Y. Iwasaki & K. Mitsubayashi, External ears for non-invasive and stable monitoring of volatile organic compounds in human blood, Scientific Reports, 2021, 11, 10415.