08 ラベル化剤

HiLyte Fluor™ 647 Labeling Kit - NH2

HiLyte Fluor™ 647 Labeling Kit - NH<sub>2</sub>

抗体・タンパク質標識キット

  • 製品コード
    LK15  HiLyte Fluor™ 647 Labeling Kit - NH2
容 量 本体価格
3 samples ¥22,200

・10 μg抗体(NH2基)への標識はコチラ

キット内容
3 samples ・NH2-Reactive HiLyte FluorTM 647
・WS Buffer
・Reaction Buffer
・Filtration Tube
3 tubes
4 mL×1
500 μL×1
3 tubes

性質

HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit - NH2は、アミノ基を有するタンパク質、特に抗体へHiLyte FluorTM 647色素を標識するためのキットである。HiLyte FluorTM 色素は米AnaSpec社が開発した蛍光色素である。キット付属のNH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は、その分子内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する分子と混合するだけで安定な共有結合を形成する。タンパク質にHiLyte FluorTM 647を標識する場合、標識反応を阻害するような低分子化合物(トリスなど)や未反応のNH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は付属のFiltration Tubeを用いて容易に除去することができる。HiLyte FluorTM 647標識IgGの場合、蛍光波長はλex/em=655/670 nmである。
 本キットには、標識に必要なすべての試薬と作製したHiLyte FluorTM 647標識体を保存するための溶液が含まれている。

開発元 Dojindo Molecular Technologies, Inc.

技術情報

特長

1) 約2時間でHiLyte FluorTM標識体が調製できる。
2) 分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。
3) 50~200 μgのタンパク質を標識可能である。
4) Filtration Tubeを用いた分離操作により抗体の場合は高い回収率で標識体が得られる。
5) 付属の保存溶液でHiLyte FluorTM標識体の保存ができる。

*使用方法はプロトコルP-9「蛍光色素を標識したい」をご覧下さい。試料中の共存物質の影響についてはその中の「使用上の注意」の項を参照。
*市販の抗体などでゼラチンやアルブミン等を安定化剤として含む場合、それらの成分を除いてからご使用ください。
*HiLyte FluorTMはAnaSpec 社の商標です。同仁化学では試験・研究用として許諾を得ております。
*NH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は、アルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、
未使用のNH2-Reactive HiLyte FluorTM 647は、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20 ℃で保存してください。
NH2-Reactive HiLyte FluorTM 647以外は、0~5 ℃で保存してください。
*冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがあります。
  これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。

キット以外に必要なもの

・10 μL, 200 μL マイクロピペッター
・インキュベーター(37℃)
・DMSO
・遠心機(マイクロチューブ用)
・マイクロチューブ(標識体保存用)

反応原理

 

 

操作方法

参考文献

参考文献を表示する

1) S. Hiroyasu, T. Ozawa, H. Kobayashi, M. Ishii, Y. Aoyama, Y. Kitajima, T. Hashimoto, J.C.R. Jones and D. Tsuruta, "Bullous pemphigoid IgG induces BP180 internalization via a macropinocytic pathway"Am. J. Pathol.., 2013, 182, (3), 828.
2) W. Jin, K. Yamada, M. Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M. Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikawa, Y. Baba, M. Ohta, "Application of IgY to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products"J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323.
3) Y. Hayashi, M. Okutani, S. Ogawa, T. Tsukahara, R. Inoue, "Generation of anti-porcine CD69 monoclonal antibodies and their usefulness to evaluate early activation of cellular immunity by flow cytometric analysis"Anim. Sci. J.., 2018, 89, (5), 825.

よくある質問

Q

Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。

A

はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。
下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗体標識プロトコル ~カスタマーサポートの視点から~」

Q

サンプルが溶液でも問題ないでしょうか?

A

溶液であること自体は問題ありません。
ただし、下記の点をご確認いただいた上でご使用ください。

-濃度-
 サンプル濃度が0.5 mg/mL以下(50 μg/100 μL以下)である場合には

 Filtration tubeを用いてサンプル量が50~200 μgとなるように
 遠心して濃縮を行ってください。
 フィルター上に残ったサンプルは再溶解させる必要はありません。
 そのまま反応にご使用ください。

-溶液量-
 Filtration tubeの容量に制限がありますので、溶液の量は100μL以下でご使用ください。

-共存物-
 ・不溶性の低分子が含まれる場合は、予め遠心して上清のみを使用してください。
 ・分子量10,000以上の物質が含まれる場合には、別途精製を行ってからご使用ください。
  (市販の抗体の中には安定化剤としてBSAやアルブミンを含む場合があります)

Q

光による退色は起こりにくいのでしょうか?

A

当社での確認試験では、HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647ともにAlexaと同等の耐光性を示しています。

Q

低分子のタンパク質(分子量50,000以下)に標識する場合の方法を教えて下さい。

A

キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、

余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、

下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して

頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。

------------------------------------------
PALL社 ナノセップ  3K 製品No.OD003C33
PALL社 ナノセップ 10K 製品No.OD010C33 
------------------------------------------

キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することが

ございますので遠心時間はご検討下さい。

Q

標識後、フィルトレーションチューブを遠心してもメンブレン上に液が残る。

A

(1)メンブレンを目視で確認した際、メンブレンカップの淵にうっすら液が残る程度であれば、
    次の操作に進んで下さい。
    メンブレン上に液が残っていたり、メンブレンカップを傾けて回転させたとき、液が
    垂れてくるようであれば、さらに遠心を8,000g で15分~30分程度行って下さい。          
   
(2)1)の遠心操作後もメンブレン上に液が残る場合は、標識体が凝集していないか確認してください。

    抗体やタンパク質自身の性質によりますが、低分子標識剤を
     標識することで抗体やタンパク質の疎水性が増し、凝集する場合がございます。

    標識体に凝集が見られる場合は、一度別のマイクロチューブに移し、遠心し上澄みを
    ご使用ください。(抗体・タンパク質の回収量は低下いたします。)

上記でも解決しない場合は、小社カスタマーサポートまでお問い合わせください。

※フィルターの目詰まりが疑われる場合は、メンブレンフィルターを新しいものに
    交換すると解決する場合がございます。 
     代替品: PALL社製 ナノセップ 30K (メーカーコード:OD030C33)

Q

IgG1分子に色素が幾つ標識されますか?

A

 IgG1分子あたり、3~7個の色素が標識されます。
プロトコルや製品添付の説明書にも標識率を計算する式を載せてあります。


HiLyte Fluor 647/タンパク質の標識率=[A655/250,000]/[(A280-A655x0.05)/ε]

A655:655nmの吸光度
A280:280nmの吸光度
ε:タンパク質の280nmのモル吸光係数(IgGの場合には216,000)

Q

未反応の色素は除去できますか?

A

説明書にある反応後の2回の洗浄で、未反応色素の95%は除去できます。

必要であれば、WS buffer等での洗浄をさらに2~3回繰り返すことで未反応色素はほぼ除去されます。

取扱条件

取扱条件
1.保存方法:冷蔵, 2.吸湿注意

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