測定原理

キットに含まれるCystine Analog (CA)は、シスチンと同様にxCTを経由して細胞に取り込まれます。細胞溶解後のReducing Agent添加で還元されたCAと検出色素FOdAが特異的に反応し、CA量に応じて緑色蛍光色素を生成します。[特許出願中]

下記ジャーナルにて技術情報を論文化しております。
Shimomura T, Hirakawa N, Ohuchi Y, Ishiyama M, Shiga M, Ueno Y, Simple Fluorescencce Assay for Cystine Uptake via the xCT in Cells Using Selenocystine and a Fluorescent Probe. ACS Sensors, 2021, 6(6), 2125-2128

実験例① xCT阻害剤(スルファサラジン、エラスチン)による評価

本キットを用いて、HeLa細胞へのスルファサラジン、エラスチンによる、シスチン取り込み阻害効果を測定しました。
スルファサラジン、エラスチンを添加した群では優位に蛍光強度が減少している結果が得られ、いずれの薬剤もシスチン取り込みを阻害することが分かりました。

検出条件
細胞      ：HeLa cells
前処理   ：DMEM (cystine-free, serum-free), 37℃, 5 min
取込条件：0.5 mmol/l  or 2 μmol/l erastin / Cystine Analog / DMEM (cystine-free, serum-free), 37℃, 30 min
測定装置：蛍光プレートリーダー
検出条件：Ex=485 nm, Em=535 nm

実験例② ラジオアイソトープ(RI)法との比較

RI測定を要していたシスチン取り込みアッセイをプレートリーダーで簡便にできるようになりました。
本製品と既存法の[¹⁴C]標識シスチンを用いたRI測定法を用いて、Wild-type(WT), xCT-knockout(KO), xCT-overexpressed(OE)の3種の細胞における取り込み量を比較しました。
その結果、どちらもWTと比較して、KOでは取り込み量が減少し、OEでは取り込み量が増加しました。
したがって、本製品はRI測定法に対して相関性があることが確認されました。

※本データは新潟大学 医学部 保健学科 生化学・分子生物学研究室　佐藤 英世 教授 及び 佐藤 茉美 特任助教よりご提供いただきました。

(WTを基準としたときの取り込み量を比較しました。)

検出条件
細胞：HT1080 cells (wild-type or xCT-knockout or xCT- overexpressed)

○Cystine Uptake Assay Kit
前処理  ：PBS (+) (cystine-free, 0.1% glucose, 0.01% Mg²⁺, 0.01% Ca²⁺), 37 ℃, 5 min
取込条件: Cystine Analog / PBS(+) (cystine-free, 0.1% glucose, 0.01% Mg²⁺, 0.01% Ca²⁺), 37℃, 30 min

○RI法
前処理  ：無し
取込条件: 0.05 mmol/l cystine + [¹⁴C]cystine (7.4 kBq/ml) /PBS(+) (0.1% glucose, 0.01% Mg²⁺, 0.01% Ca²⁺), 37℃, 2 min

実験例③ エラスチン処理による栄養素取り込み量の増減と、レドックスバランスの変化

xCT阻害剤であるエラスチンを処理したA549細胞における、栄養素取り込み量の増減と、レドックスバランスの変化を確認しました。
その結果、主に以下3点を確認することができました。
・シスチン取り込みの阻害によるシステインの喪失を補うために、アミノ酸の取り込みが増加しました。
・グルコースの取り込みの減少が見られ、代謝のリプログラミングが行われた可能性が考えられます。
・シスチン取り込み阻害によるグルタチオンの減少により、Fe²⁺とROS, 過酸化脂質の量が増加しました。

<使用製品>

<実験条件>
細胞：A549細胞
培養条件：100 μmol/l Erastin/MEM, 37℃, 3h