Cystine Uptake Assay Kit

Cystine Uptake Assay Kit

シスチン取り込み検出キット

  • シスチン取り込み能力を簡便に検出できる
  • プレートリーダーを用いて検出が可能
  • 製品コード
    UP05  Cystine Uptake Assay Kit
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
20 tests ¥18,000 344-09951
100 tests ¥50,000 340-09953

<使用回数の目安> 100 testsあたり、96-well plate 1枚

キット内容
20 tests Cystine Analog Solution
Fluorescent Probe
Reducing Agent
Assay Buffer
45 μl×1
×1
×1
5 ml×1
100 tests Cystine Analog Solution
Fluorescent Probe
Reducing Agent
Assay Buffer
225 μl×1
×1
×2
25 ml×1

性質

シスチンは、シスチントランスポーターであるxCTによって細胞内に取り込まれており、抗酸化物質であるグルタチオン(GSH)の原料となるため、細胞内のレドックスバランスの制御に重要な役割を果たしています。
多くのがん細胞ではxCTを介したシスチン取り込みが亢進しており、細胞内のグルタチオン量を高レベルに保つことによって細胞内レドックスを制御しています。また、このような高レベルの細胞内グルタチオンが、がん細胞における薬剤耐性に寄与することが明らかとなっています。
そのため、近年xCTは癌治療のターゲットの一つとして注目されています。xCT阻害剤であるスルファサラジンやエラスチンは、シスチン取り込みを阻害することによって細胞内グルタチオン量を低下させ、細胞死の一つであるフェロトーシスを誘導することが知られています。また、免疫細胞では活性化時にxCTを高発現することが知られており、シスチン取り込みを介した細胞内レドックス制御が免疫応答にも重要であることが示唆されています。

30秒解説:グルコース取り込み検出キット

再生すると音声が流れます

本解説動画では、グルコース取り込み検出の目的から、従来測定法との比較・実験例を交え本製品の特徴を解説します。

技術情報

この製品でできること

本キットはCystine Analog (CA)としてSelenocystineを用いており、細胞のシスチン取り込み能力を短時間の操作で簡便にプレートリーダーにて測定することが可能です。

測定原理

キットに含まれるCystine Analog (CA)は、シスチンと同様にxCTを経由して細胞に取り込まれます。細胞溶解後のReducing Agent添加で還元されたCAと検出色素FOdAが特異的に反応し、CA量に応じて緑色蛍光色素Fluoresceinを生成します。[特許出願中]

下記ジャーナルにて技術情報を論文化しております。
Shimomura T, Hirakawa N, Ohuchi Y, Ishiyama M, Shiga M, Ueno Y, Simple Fluorescencce Assay for Cystine Uptake via the xCT in Cells Using Selenocystine and a Fluorescent Probe. ACS Sensors, 2021, 6(6), 2125-2128

実験例① xCT阻害剤(スルファサラジン、エラスチン)による評価

本キットを用いて、HeLa細胞へのスルファサラジン、エラスチンによる、シスチン取り込み阻害効果を測定しました。
スルファサラジン、エラスチンを添加した群では優位に蛍光強度が減少している結果が得られ、いずれの薬剤もシスチン取り込みを阻害することが分かりました。

検出条件
細胞      :HeLa cells
前処理   :DMEM (cystine-free, serum-free), 37℃, 5 min
取込条件:0.5 mmol/l sulfasalazine or 2 μmol/l erastin / Cystine Analog / DMEM (cystine-free, serum-free), 37℃, 30 min
測定装置:蛍光プレートリーダー
検出条件:Ex=485 nm, Em=535 nm

実験例② ラジオアイソトープ(RI)法との比較

RI測定を要していたシスチン取り込みアッセイをプレートリーダーで簡便にできるようになりました。
本製品と既存法の[14C]標識シスチンを用いたRI測定法を用いて、Wild-type(WT), xCT-knockout(KO), xCT-overexpressed(OE)の3種の細胞における取り込み量を比較しました。
その結果、どちらもWTと比較して、KOでは取り込み量が減少し、OEでは取り込み量が増加しました。
したがって、本製品はRI測定法に対して相関性があることが確認されました。

※本データは新潟大学 医学部 保健学科 生化学・分子生物学研究室 佐藤 英世 教授 及び 佐藤 茉美 特任助教よりご提供いただきました。


(WTを基準としたときの取り込み量を比較しました。)

検出条件
細胞:HT1080 cells (wild-type or xCT-knockout or xCT- overexpressed)

○Cystine Uptake Assay Kit
前処理  :PBS (+) (cystine-free, 0.1% glucose, 0.01% Mg2+, 0.01% Ca2+), 37 ℃, 5 min
取込条件: Cystine Analog / PBS(+) (cystine-free, 0.1% glucose, 0.01% Mg2+, 0.01% Ca2+), 37℃, 30 min

○RI法
前処理  :無し
取込条件: 0.05 mmol/l cystine + [14C]cystine (7.4 kBq/ml) /PBS(+) (0.1% glucose, 0.01% Mg2+, 0.01% Ca2+), 37℃, 2 min

実験例③ エラスチン処理による栄養素取り込み量の増減と、レドックスバランスの変化

xCT阻害剤であるエラスチンを処理したA549細胞における、栄養素取り込み量の増減と、レドックスバランスの変化を確認しました。
その結果、主に以下3点を確認することができました。
・シスチン取り込みの阻害によるシステインの喪失を補うために、アミノ酸の取り込みが増加しました。
・グルコースの取り込みの減少が見られ、代謝のリプログラミングが行われた可能性が考えられます。
・シスチン取り込み阻害によるグルタチオンの減少により、Fe2+とROS, 過酸化脂質の量が増加しました。

<使用製品>

① アミノ酸取り込み Amino Acid Uptake Assay Kit (製品コード:UP04)
② グルコース取り込み Glucose Uptake Assay Kit-Green (製品コード:UP02)
③ シスチン取り込み :Cystine Uptake Assay Kit (製品コード:UP05)
④ 細胞内グルタチオン量 GSSG/GSH Quantification Kit (製品コード:G257)
⑤ 細胞内鉄イオン FerroOrange (製品コード:F374)
⑥ 細胞内トータルROS ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- (製品コード:R252)
⑦ 細胞内過酸化脂質 Liperfluo (製品コード:L248)

 

<実験条件>
細胞:A549細胞
培養条件:100 μmol/l Erastin/MEM, 37℃, 3h

参考文献

参考文献を表示する

文献No. 対象サンプル 装置 引用(リンク)
1) 細胞
(A172; LN229)
プレートリーダー K. Hayashima, H. Katoh, "Expression of gamma-glutamyltransferase 1 in glioblastoma cells confers resistance to cystine deprivation-induced ferroptosis", J. Biol. Chem.2022, doi:10.1016/j.jbc.2022.101703.

よくある質問

Q

Cystine Analogはどのトランスポーターを介して取り込まれるのでしょうか?

A

Cystine Analogはシスチン・グルタミン酸トランスポーター(xCT)を介して細胞内へ取り込まれます。

Q

細胞種の実績を教えて下さい。

A

下記の細胞において使用実績があります。

由来 細胞名
ヒト神経膠芽腫由来細胞 A172
ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞 A549
ヒト悪性黒色種 A375
ヒト結腸腺癌 HCT116
ヒト子宮頸癌由来細胞 HepG2
白血病細胞 HL60
ヒトサルコーマ細胞 HT1080
マウス胚性線維芽細胞 MEF
ヒト肺小細胞​癌 SBC-5
アストロサイト―マ U-251 MG

 

 

 

Q

Cystine Analogは細胞内に取り込まれた後、分解・代謝されるのでしょうか?

A

Cystine Analogは安定な構造を有しているため、実験操作内において分解されることはございません。

Q

Cystine uptake solutionは保存可能でしょうか?

A

Cystine uptake solutionは保存できません。添加前に必要量のCystine uptake solutionを調製して下さい。

Q

シスチンを定量することはできますか?

A

本製品を用いてシスチンを定量することはできません。

Q

細胞内に取り込まれたCystine Analogを定量することはできますか?

A

細胞内に取り込まれたCystine Analogを定量することはできません。本製品は、シスチン取り込み能力を数値化するためのキットです。

Q

蛍光シグナルの変化が観察されない場合、どうすればいいですか?

A

取扱説明書 操作3, 4のインキュベーション時間を長くしてください。

Q

バックグラウンドが高い場合、どうすればいいですか?

A

・細胞に取り込まれなかったCystine Analogがウェル内に残存している可能性があります。取扱説明書 操作5のPBSによる洗浄を繰り返してください。
・Working solutionは時間をおかずに添加してください。

Q

シスチン不含無血清培地以外にCA Uptake solutionの調製に使用できるバッファーはありますか?

A

HeLa細胞においてHBSSや0.1%Glucoseを含むPBS(+)を使用して測定した実績がございます。

Q

蛍光強度を細胞数で補正する方法を教えてください。

A

核酸染色剤による補正が可能です。また、小社製品"Cell Count Normalization Kit (製品コード:C544)"を用いて細胞数をカウントし、補正することも可能です。

Q

蛍光測定用のマイクロプレートはどのようなものが使えますか?

A

使用実績のあるマイクロプレートは下記の通りです。

社名 製品名 Cat No.
ibidi μPlate 96 well ibiTreat black S 15 ib89626
AGC techno glass EZVIEW Glass Bottom Culture Plate LB 96well 5866-096
Thermo Fisher 96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface, Pack of 10 165305

取扱条件

取扱条件
1. 医薬用外毒物, 2. 保存方法:冷凍(-20℃)
危険・有害
シンボルマーク
どくろ腐食性健康有害性環境
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