02 酸化ストレス関連試薬

ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-

トータルROS検出キット

トータルROSを高感度に検出
蛍光顕微鏡、プレートリーダー、フローサイトメーターで検出可能

製品コード

R252　 ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
100 tests	￥20,700	340-09811

キット内容

100 tests	・Highly Sensitive DCFH-DA Dye ・loading Buffer (10x)	10 μl×1 1.0 ml×1

試験成績書

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性質

ROS (Reactive oxygen species)は主にミトコンドリアでのATP合成過程で発生する反応性の高い酸素種です。情報伝達のシグナル物質としての役割や、マクロファージなどの免疫機能の一部として重要である一方、DNAやタンパク質に対し酸化剤として作用することで様々な疾病や老化を引き起こす要因となります。

最近の研究では、二価鉄を触媒とし誘発するフェントン反応によって起こる新しい細胞死 (フェロトーシス)の分野においてもROSが注目されてきており、ROSを検出する意義はますます高まってきています。ROSを測定する色素としてDCFH-DAが広く使われますが、感度が低くバックグラウンド蛍光との差が明瞭ではありません。本キットはROSを高感度に検出でき、キット付属のBufferを使って染色することで、より細胞にダメージを与えにくい状態でROSを検出することができます。

関連製品：耐光性トータルROS検出キットバックグラウンドや観察光の影響が課題の方は、是非ご確認ください。

マニュアル

技術情報

比較表：既存試薬との性能

弊社ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-を含む、一般的に知られている既存色素との比較表を下記に示します。

	同仁化学研究所		T社
品コード	R252	R253	-	-
製品名	本製品 ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-	関連製品 ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-	D色素	C色素
感度 (細胞染色時)	◎ 最も感度が高い	○ 既存色素に比べ感度が高い	△ 感度が低い	△ 感度が低い
耐光性 ※観察光による自動酸化	× 観察光による自動酸化あり	◎ 最も耐光性が高い	× 観察光による自動酸化あり	× 観察光による自動酸化あり
固定化操作	× 固定化不可	◎ 固定化可能	× 固定化不可	○ 固定化可能

既存試薬との比較

活性酸素種に対する反応選択性

Highly Sensitive DCFH-DAは活性酸素種（ROS）に対して、DCFH-DAと同様の反応性を示します。
また、DCFH-DAと同様の蛍光特性（λex：505 nm、λem：525 nm）を持つため、同じ励起・蛍光波長での検出が可能です。

検出感度の比較

過酸化水素処理したHeLa細胞（1×10⁴ cells/ml）をDCFH-DAまたはROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-で染色し、細胞内ROSの検出能を比較しました。結果、いずれの検出装置においてもROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-ではDCFH-DAよりも高感度に細胞内のROSを検出できました。

①蛍光顕微鏡での検出
※Highly Sensitive DCFH-DAの観察条件で比較

（スケールバー：50 µm）

<検出条件>
GFPフィルター(Ex. 450 - 490 nm / Em. 500 - 550 nm)
細胞種：HeLa細胞

②蛍光プレートリーダーでの検出

<検出条件>
Ex. 490 - 520 nm / Em. 510 - 540 nm
細胞種：HeLa細胞

③フローサイトメーターでの検出

<検出条件>
FITC laser gain：215 V
細胞種：HeLa細胞

実験例：エラスチン処理した細胞の内在性ROS検出

エラスチン処理により、シスチン / グルタミン酸トランスポーター (xCT) を阻害すると、鉄依存性の細胞死であるフェロトーシスが誘導されることが知られています。エラスチン処理した A549 細胞において、細胞内ROSの変化をイメージングしたところ、エラスチン処理によってROSが増加する結果が得られました。

（スケールバー：50 µm）

<検出条件>
細胞内ROS（Highly Sensitive DCFH-DA Dye）： GFPフィルター(Ex. 450 - 490 nm / Em. 500 - 550 nm)

<実験操作>
(1) ibidi 8 well plateにA549細胞（1×10⁴ cells, DMEM, 10% fetal bovine serum,1% penicillin-streptomycin）を播種
(2) インキュベーター内（37℃、5% CO₂存在下）で一晩培養
(3) 培地を取り除き、DMEM培地で希釈した 50 μmol/l のエラスチンを添加
(4) インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下)で一晩培養
(5) 上清を取り除きHBSSで細胞を2回洗浄後、Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solutionを添加
(6) インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下)で30分間インキュベート
(7) Working solutionを除去し、HBSSを用いて細胞を2回洗浄後にHBSSを加え蛍光顕微鏡で観察

実験例：LPS処理したマクロファージの内在性ROS検出

LPS（Lipopolysaccharide）処理した RAW264.7 細胞において、細胞内ROSの変化をイメージングしたところ、LPS処理によって細胞内のROSが増加する結果が得られました。

（スケールバー：50 µm）

<検出条件>
細胞内ROS（Highly Sensitive DCFH-DA Dye）： GFPフィルター(Ex. 450 - 490 nm / Em. 500 - 550 nm)

<実験操作>
(1) ibidi 8 well plateに RAW264.7 細胞（3×10⁴ cells, DMEM, 10% fetal bovine serum,1% penicillin-streptomycin）を播種
(2) インキュベーター内（37℃、5% CO₂存在下）で一晩培養
(3) 培地を取り除き、HBSSで細胞を2回洗浄後、DMEM培地で希釈した 500 ng/ml のLPSを添加
(4) インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下)で20時間培養
(5) 上清を取り除きHBSSで細胞を2回洗浄後、Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solutionを添加
(6) インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下)で30分間インキュベート
(7) Working solutionを除去し、HBSSを用いて細胞を2回洗浄後にHBSSを加え蛍光顕微鏡で観察

実験例：Sulfasalazine (SSZ) による細胞内代謝の変化

シスチン / グルタミン酸トランスポーター (xCT) を阻害することが知られている Sulfasalazine (SSZ) を A549細胞へ添加後、細胞内のROS、ATP、α-ケトグルタル酸(α-KG)、グルタチオン (GSH)の変化と、グルタミン酸放出量の変化を確認しました。
その結果、SSZ 添加により細胞内のATP、グルタチオン(GSH)ならびにグルタミン酸放出量は減少し、細胞内のα-ケトグルタル酸とROSは増加しました。

<使用製品>
・細胞内ATP ：ATP Assay Kit-Luminescence (製品コード：A550)
・細胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric (製品コード：K261)
・細胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit (製品コード：G257)
・グルタミン酸放出量：Glutamate Assay Kit-WST (製品コード：G269)

<実験条件>
　細胞：A549細胞 (1 x 10⁶ cells) 　暴露時間：48時間

（スケールバー：50 µm）

参考文献) Shogo Okazaki et al., "Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma". Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

蛍光特性

参考文献

参考文献を表示する

文献No.	対象サンプル	装置	引用（リンク）
1)	細胞 U-251MG cells(ヒトグリア芽腫・アストロサイトーマ )	蛍光顕微鏡	S. Kato, "Effects of platinum‑coexisting dopamine with X‑ray irradiation upon human glioblastoma cell proliferation", Hum. Cell, 2021, doi:10.1007/s13577-021-00591-3.
2)	細胞 Valve Interstitial Cells(弁間質細胞)	蛍光顕微鏡	K. Kanno, T. Sakaue, M. Hamaguchi, K. Namiguchi, D. Nanba, J. Aono, M. Kurata, J. Masumoto, S. Higashiyama, H. Izutani, "Hypoxic Culture Maintains Cell Growth of the Primary Human Valve Interstitial Cells with Stemness", Int. J. Mol. Sci. 2021, doi:10.3390/ijms221910534.
3)	細胞 BPH-1細胞(LPS誘導)	フローサイトメーター	C. Fang, L. Wu, M. Zhao, T. Deng, J. Gu, X. Guo, C. Li, W. Li, X. Zeng, "Periodontitis Exacerbates Benign Prostatic Hyperplasia through Regulation of Oxidative Stress and Inflammation", Oxid. Med. Cell. Longevity, 2021, doi:10.1155/2021/2094665.
4)	菌（Synechococcus elongatus PCC7942)	プレートリーダー	M. Tamoi and S. Shigeoka, "CP12 Is Involved in Protection against High Light Intensity by Suppressing the ROS Generation in Synechococcus elongatus PCC7942", Plants, 2021, doi:10.3390/plants10071432.
5)	細胞 SW982(ヒト滑膜肉腫細胞株)	蛍光顕微鏡	S. Xia, Z. Ma, B. Wang, F. Gao, C. Yi, X. Zhou, S. Guo, L. Zhou, "In vitro anti-synovial sarcoma effect of diallyl trisulfide and mRNA profiling", Gene, 2021, doi:10.1016/j.gene.2021.146172.
6)	細胞 BRL3A(肝由来細胞株)	蛍光顕微鏡	Z. Luo, Q. Gao, H. Zhang, Y. Zhang, S. Zhou, J. Zhang, W. Xu, J. Xu, " Microbe-derived antioxidants attenuate cobalt chloride-induced mitochondrial function, autophagy and BNIP3-dependent mitophagy pathways in BRL3A cells", 2022, doi:10.1016/j.ecoenv.2022.113219.
7)	細胞 (骨髄由来抑制細胞)	フローサイトメーター	Z. Xie, T. Kawasaki, H. Zhou, D. Okuzaki, N. Okada and M. Tachbana, "Targeting GGT1 Eliminates the Tumor-Promoting Effect and Enhanced Immunosuppressive Function of Myeloid-Derived Suppressor Cells Caused by G-CSF", Front. Pharmacol., 2022, doi:10.3389/fphar.2022.873792.
8)	細胞 TIG-1 (老化研究用、ヒト胎児肺由来線維芽細胞)	蛍光顕微鏡	Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, "Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts", 2022, doi:10.1016/j.exger.2022.111866.
9)	細胞 (SK-Hep1)	蛍光顕微鏡	G. Tsujimoto, R. Ito, K. Yoshikawa, C. Ueki and N. Okada, "NFYA promotes the anti-tumor effects of gluconeogenesis in hepatocellular carcinoma through the regulation of PCK1 expression", 2022, doi:10.3389/fcell.2022.983599.

よくある質問

Q 1キットで測定可能なサンプル数を教えてください。: A

測定可能なサンプル数は以下をご参考ください。
・ 96-well plate：1枚
・ ibidi 8-well plate：6枚
・ 35 mm dish：5枚
・ 6-well plate：5ウェル

Q ポジティブコントロールになる実験例はありますか？: A

取扱説明書に過酸化水素処理をしたHeLa細胞による検出例を掲載しております。

Q Highly Sensitive DCFH-DA working solutionはLoading Buffer以外でも調製できますか？: A

染色時の細胞へのダメージを軽減するため付属のLoading Bufferを推奨しますが、Hanks’ HEPESやHBSSでも調製できます。
培地で調製する場合は無血清培地をご使用ください。

Q 染色後の洗浄には、HBSSの代わりにPBSを使用できますか？: A

細胞へのダメージを軽減するためHBSSを推奨しております。
HBSSがお手元にない場合は培地での洗浄をお勧めします。

Q 蛍光顕微鏡でイメージングする際の注意点はありますか？: A

色素はROSと反応し、酸化することで蛍光を発します。
励起光を照射し続けると色素が酸化されることでバックグラウンドが上昇するため、イメージング画像を取得する際は明視野でピントを調整後に蛍光画像を取得してください。

観察光の影響により撮影が困難であった場合は、下記製品がおすすめです。
製品コード: R253、製品名: ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-

Q フローサイトメーターで使用する際、細胞を剥がす操作はどの段階で行えば良いですか？: A

取扱説明書操作6の後(薬剤処理しHBSSで洗浄した後)に細胞を剥がす操作(トリプシン処理)を行ってください。
トリプシン処理後は、培地を添加し反応を止めた後、遠心しHBSSで１回洗浄後、
さらに遠心しHBSSで細胞を懸濁して測定サンプルとしてください。