02 酸化ストレス関連試薬

Liperfluo

Liperfluo

過酸化脂質検出試薬

  • 製品コード
    L248  Liperfluo
  • CAS番号
    1448846-35-2
  • 化学名
    N-(4-Diphenylphosphinophenyl)-N'-(3,6,9,12-tetraoxatridecyl)perylene-3,4,9,10-tetracarboxydiimide
  • 分子式・分子量
    C51H41N2O8P=840.85
容 量 本体価格
50 μg x5 ¥20,600

性質

Liperfluo は、Spy-LHP の類似化合物で、過酸化脂質検出用の試薬であり、過酸化脂質で特異的に酸化されエタノール等の有機溶媒中で強い蛍光を発します(図1,2)。Liperfluo 酸化体の励起波長および蛍光波長はそれぞれ524 nm、535 nm で、測定試料への光によるダメージや試料由来の自家蛍光の影響を軽減できます。本試薬は、ジイソキノリン環の片方にテトラエチレングリコール基が導入されたもので、Spy-LHP よりも水系バッファー中での分散性が向上しています。Liperfluo 酸化体は水中ではほとんど蛍光を発しないが、細胞膜等の脂溶性の高い部位では蛍光性となることから、容易に蛍光顕微鏡による生細胞の過酸化脂質のイメージングやフローサイトメトリーによる細胞の過酸化脂質量の分析に使用することができます。

特長 
1) 細胞の過酸化脂質のイメージングや検出ができる
2) 長波長励起のため、細胞への光ダメ―ジや自家蛍光の影響を軽減できる
3) 過酸化脂質特異性が高い

マニュアル

技術情報

図1 過酸化脂質によるLiperfluoの励起および蛍光スペクトル変化(エタノール溶媒中)

図2  Liperfluoの活性酸素種に対する反応選択性

操作手順
・使用細胞:SH-SY5Y
 6 well Plateに播種(60x105 cell/well)
 ↓終夜(37℃, CO2インキュベート)
・LjperfluoのDMSO溶液を添加(終濃度:20 μM)
 ↓15min (37℃, CO2インキュベート)
・Cumene添加(終濃度:100 μM)
 ↓2h (37℃, CO2インキュベート)
・蛍光顕微鏡で測定
 装置:Olympus IX-71 epifluorescent microscope)
 ミラーユニット:U-MNIBA3
 露光時間:10sec
 lSO感度:800

図3 SH-SY5Y 細胞における各種薬剤刺激による過酸化脂質イメージング
   薬剤による酸化ストレス刺激により明確な蛍光増加が確認できる。
  Control、 Cumene それぞれの蛍光及び明視野画像。

操作手順
・使用細胞:L929細胞(マウス繊維芽細胞由来培養細胞株)
 35 mmガラスボトムディッシュに播種(2.5x105 cell/well)
 ↓一昼夜培養(37℃, CO2インキュベート)
・培地除去後、Liperfluoを含む新しい培地を添加(終濃度:1 μM)
 ↓30 min(37℃, CO2インキュベート)
・培地除去後、t-BHPを含む新しい培地を添加(終濃度:250 μM)
 ↓2 h(37℃, CO2インキュベート)
・共焦点レーザー顕微鏡にて観察
  装置:Zeiss LSM510META
  フィルターセット:FITC(GFP, Alexa488)wide filter
           HFT UV/488
           NFT490
           BP505-550

フェロトーシス研究での評価例

細胞死メカニズムの一つとして注目を集めるフェロトーシス研究においてLiperfluo が使われています。

<Liperfluo を用いた論文>

サンプル(フェロトーシス誘導法) 論文情報タイトル
ヒト気管支上皮細胞
(RSL3 及び菌培養上清の添加)
Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium.
マウス繊維芽細胞
(RSL3 の添加)
Oxidized arachidonic and adrenic PE s navigate cells to ferroptosis.
HeLa 細胞
(Erastin 又はBrefeldin A の添加)
Golgi stress mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells.

溶解例

0.8 mg /1 mL ジメチルスルホキシド

参考文献

参考文献を表示する

1) N. Soh, T. Ariyoshi, T. Fukaminato, H. Nakajima, K. Nakano and T. Imato, "Swallow-tailed Perylene Derivative: a new Tool for Fluorescent Imaging of Lipid Hydroperoxides", Org. Biomol. Chem., 20075, 3762.
2) K. Yamanaka, Y. Saito, J. Sakiyama, Y. Ohuchi, F. Oseto and N. Noguchi, "A Novel Fluorescent Probe with High Sensitivity and Selective Detection of Lipid Hydroperoxides in Cells"RSC Adv., 20122, (20), 7894.
3) V. E. Kagan, G. W. Mao, F. Qu, J. P. F. Angeli, S. Doll, C. S. Croix, H. H. Dar, B. Liu, V. A. Tyurin, V. B. Ritov, A. A. Kapralov, A. A. Amoscato, J. Jiang, T. Anthonymuthu, D. Mohammadyani, Q. Yang, B. Proneth, J. K. Seetharaman, S. Watkins, I. Bahar, J. Greenberger, R. K. Mallampalli, B. R. Stockwell, Y. Y. Tyurina, M. Conrad and H. Bayır, "Oxidized arachidonic and adrenic PEs navigate cells to ferroptosis"Nature Chemical Biology., 2017, 13, (1), 81.
4)Y. Nakashima, S. Ohta, A. M. Wolf, "Blue light-induced oxidative stress in live skin."Free Radical Biology and Medicine., 2017, 108, 300.
5) M. Tsugita, N. Morimoto and M. Nakayama, "SiO2 and TiO2 nanoparticles synergistically trigger macrophage inflammatory responses"Particle and Fibre Toxicology., 2017, DOI 10.1186/s12989-017-0192-6.
6) K. Iuchi, A. Imoto, N. Kamimura, K. Nishimaki, H. Ichimiya, T. Yokota and S. Ohta, "Molecular hydrogen regulates gene expression by modifying the free radical chain reactiondependent generation of oxidized phospholipid mediators"Scientific Reports., 2016, DOI: 10.1038/srep18971.
7) A. J. Clark, and H. R. Petty., "WO3/Pt nanoparticles promote light-induced lipid peroxidation and lysosomal instability within tumor cells."Nanotechnology., 2016, 27, (7), 075103.
8) T. Otani, M. Matsuda, A. Mizokami, N. Kitagawa, H. Takeuchi, E. Jimi, T. Inai and M. Hirata, "Osteocalcin triggers Fas/FasL-mediated necroptosis in adipocytes via activation of p300"Cell Death Dis., 2018, 9, 1194.
9) H.H. Dar, Y.Y. Tyurina, K. Mikulska-Ruminska, I. Shrivastava, H.C. Ting, V.A. Tyurin, J. Krieger, C.M. St Croix, S. Watkins, E. Bayir, G. Mao, C. Ambruster, A. Kapralov, H. Wang, M.H. Parsek, T.S. Anthonymuthu, A.F. Ogunsola, B.A. Flitter, C.J. Freedman, J.R. Gaston, T.R. Holman, J.M. Pilewski, J.S. Greenberger, R.K. Mallampalli, Y. Doi, J.S. Lee, I. Bahar, J.M. Bomberger, H. Bayır, V.E. Kagan, "Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium."J. Clin. Invest.., 2018,DOI: 10.1172/JCI99490. .
10) H. Alborzinia, T. I. Ignashkova, F. R. Dejure, M. Gendarme, J. Theobald, S. Wolfl, R. K. Lindemann and J. H. Reiling , "Golgi stress mediates redox imbalance and ferroptosis in human cells"Commun Biol.., 2018, 1, (210), DOI: 10.1038/s42003-018-0212-6.
11) W. Wang, M. Green, J. E. Choi, M. Gijon, P. D. Kennedy, J. K. Johnson, P. Liao, X. Lang, I. Kryczek, A. Sell, H. Xia, J. Zhou, G. Li, J. Li, W. Li, S. Wei, L. Vatan, H. Zhang, W. Szeliga , W. Gu, R. Liu, T. S. Lawrence, C. Lamb, Y. Tanno, M. Cieslik, E. Stone, G. Georgiou, T. A. Chan, A. Chinnaiyan, W. Zou, "CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy."Nature., 2019, 569, (7755), 270.

よくある質問

Q

S343 Spy-LHPとの違いは何ですか?

A

DMSOへの溶解性が増し、生細胞の過酸化脂質の染色が容易になりました。
溶解例:1mmol/L (50 ug/60uL DMSO)

Q

蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーで観察する際、どの励起フィルター、レーザーが使用可能でしょうか?

A

蛍光顕微鏡の場合、GFPフィルター(励起:450-490 nm, 蛍光:500-545 nm)やFITCフィルター(励起:467-498 nm, 蛍光:513-556 nm)が使用可能です。

フローサイトメトリーの場合は、488nmで励起可能です。

Q

培地中のフェノールレッドや血清の影響はありますか?
また、バックグランドが高い場合や、蛍光が弱い(probeが光らない)場合に改善する点はありますか?

A

フェノールレッドや血清入り培地でも使用可能です。
ただし、バックグランドが高い場合はPBSに置換して下さい。
  
また、バックグランドが高い場合、Liperfluoが光により自然酸化されている可能性があります。
インキュベーション時もなるべく遮光するようにしてください。
(溶解後は必ずアルミ箔などで遮光してください。)

蛍光強度が弱い場合、反応時間を長くしてもバックグランドも高くなってしまうためお勧めできません。
そのため、装置の測定(蛍光観察)の条件を調整してください。
→励起光の強度を強くする。
→露光時間を長くする。

Q

浮遊細胞と付着細胞のどちらでも使用可能でしょうか?
また、固定化した細胞を染色することはできますか?

A

浮遊細胞、付着細胞、どちらでも使用可能です。
HL-60細胞(浮遊細胞)、CHO細胞・SH-SY5Y細胞(付着細胞)で実績があります。
固定化した細胞では染色することはできません。

取扱条件

規格
性状: 本品は、暗赤色結晶性粉末又は固体である。
純度(HPLC): 90.0% 以上
NMRスペクトル: 試験適合
取扱条件
1.保存方法:冷蔵,遮光, 2.窒素置換

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