05 細胞染色用色素

MitoBright LT Deep Red

MitoBright LT Deep Red

ミトコンドリア染色用色素 Deep Red

  • 長時間 細胞に滞留する
  • 血清培地中で染色できる
  • 蛍光顕微鏡・フローサイトメーターに対応
  • 製品コード
    MT12  MitoBright LT Deep Red
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
400 μl ¥12,800 340-92081

性質

ミトコンドリアは細胞内のエネルギー生産のみならずさまざまな細胞機能に関与する多機能なオルガネラであり、活発な融合と分裂サイクルによりその形態を変化させています。これはミトコンドリアダイナミクスと言われ、最近では、ミトコンドリアの形態制御異常が神経変性疾患、代謝疾患や老化などに関与することからミトコンドリアの動態を長期間観察する需要が増えています。

 

ミトコンドリア形態観察・ミトコンドリア膜電位観察のコツ

実験成功のための「購入前の抑えるポイント・実験のコツ」について、実際に小社で取得したデータを用い動画で判りやすく解説しています。​​​​​

① ミトコンドリア形態・動態観察のコツ [2:10~]

1.染色方法の選定

      低分子蛍光色素・蛍光タンパクの遺伝子発現・免疫染色法

2.染色色素の特性を理解する

  蛍光特性、染色後の結合性、染色の方法

3.観察時の確認事項と検討方法

  蛍光の漏込・Z軸の情報・タイムラプスイメージング

② ミトコンドリア膜電位観察のコツ [16:17~]

既存の低分子色素「JC-1, TMRE,TMRM, MT-1」について

1.各色素の特性

2.耐光性とタイムラプスイメージング

3.固定化操作の影響

技術情報

MitoBright LT は、他とココが違う

長時間 細胞に滞留する


染色後4日間継続培養したミトコンドリア

血清培地中で染色できる


染色後4日間継続培養したミトコンドリア

蛍光顕微鏡・フローサイトメーターに対応


染色後4日間継続培養したミトコンドリア

長時間 細胞に滞留する

HeLa 細胞をHBSS にて洗浄後、各MitoBright LT または既存試薬にて染色し、血清入り培地に入れ替え、4 日間培養後ミトコンドリアを観察しました。その結果、既存試薬は蛍光強度が4 日後に大きく低下したのに対し、 MitoBright LT は蛍光強度が維持され、ミトコンドリアを明瞭に観察できました。さらに継続して培養を行った結果、 MitoBright LT は7 日後もミトコンドリアに滞留していることが確認されました。

<検出条件>
MitoBright LT Green 、既存試薬(T 社)Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm
MitoBright LT Red 、既存試薬(T 社)Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm
MitoBright LT Deep Red 、 既存試薬(T 社)Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm


小社のミトコンドリア染色試薬MitoBright LTシリーズは、世界的に広くご愛顧いただき多くの論文に掲載されています。

製品名 サンプル 染色後の
観察時間
測定機器 ジャーナル(リンク)
MitoBright LT Green 細胞 (C2C12) 5日間 蛍光顕微鏡 Polymers
MitoBright LT Green 細胞 (BMM) 36時間 or 3日間  蛍光顕微鏡/
フローサイトメーター
JCI Insights
MitoBright LT Red 細胞 (A11 cells/ P29 cells) 3日間 蛍光顕微鏡 BMC Mol. Cell Biol.
MitoBright LT Deep Red 細胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7 ) 8時間 蛍光顕微鏡 Advanced Therapeutics
MitoBright LT Deep Red 細胞 (4T1) 24時間 蛍光顕微鏡 Advanced Functional Materials

血清入りの培地で染色できる

MitoBright LT と既存試薬にて、血清有無の培地で染色しました。既存試薬は血清入り培地で染色した場合、蛍光が暗くなるのに対し、MitoBright LT は血清入り培地中で染色しても蛍光強度が低下することがなく、ミトコンドリアを明瞭に染色しました。

ミトコンドリアの分裂と融合の様子

HeLa細胞をMitoBright LT Deep Redにて染色後、血清入り培地に入れ替えミトコンドリアの形態を30分間観察しました。

<測定装置>
共焦点レーザー顕微鏡、倍率 63倍

<観察条件>
Ex 640 nm、Em 650-700 nm
 

超解像レーザー顕微鏡(STED)によるミトコンドリア内部構造の観察

ミトコンドリア病の原因変異を有するサイブリッド細胞を、MitoBright LT Deep Redにて染色し超解像レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、ミトコンドリアのクリステ構造の異常が確認されました。

 
                                コントロールサイブリッド細胞                                                              ミトコンドリア病の原因変異を有するサイブリッド細胞

<実験条件>
色素:MitoBright LT Deep Red (100 nmol/l)
装置:Leica 超解像レーザー顕微鏡TCS SP8 STED 3X
Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm
STEDレーザー:775 nm

<実験手順>
1. ガラスベースディッシュに細胞を播種し、インキュベーター(37℃、5% CO2)内で2日間培養。
2. 培地を取り除き、L-15培地(10% FBS含有)で調製したMitoBright LT Deep Red (100 nmol/l)を添加。
3. インキュベーター(37℃、5% CO2)内で45分間インキュベート。
4. 上澄みを取り除き、HBSSで2回洗浄。
5. L-15培地(10%FBS含有)を添加し、超解像レーザー顕微鏡(Leica TCS SP8 STED 3X)で観察。

※本データは、東京都健康長寿医療センター研究所 老化制御研究チーム 大澤 郁朗様、藤田泰典様よりご提供頂きました。 

コラーゲンコートプレートを用いたミトコンドリア検出

ミトコンドリアの形態観察において、コラーゲンコートしたガラスプレートを使用する場合があります。
既存のミトコンドリア染色試薬は、コラーゲンに吸着しバックグラウンドを上昇させる問題がありましたが、MitoBright LTシリーズはバックグラウンドの影響がなく鮮明にミトコンドリアを染色できます。

MitoBright LT Deep Red

既存試薬(MitoBright Deep Red)

  スケールバー: 50 μm

<染色条件>
HeLa細胞をコラーゲンコートプレートに播種し、24時間培養後 上澄みを抜き取り、HBSS にて洗浄した。
100 nmol/l MitoBright LT  Deep Red working solution を添加し30分インキュベート後上澄みを抜き取り、HBSS にて洗浄し蛍光顕微鏡で観察した。

<観察条件>
Ex 640 nm,   Em 650–700 nm

<結果>
既存試薬はバックグラウンドが見られましたが、MitoBright LTで染色したミトコンドリアはバックグラウンドの影響がなく、鮮明にミトコンドリアを染色しました。

フローサイトメーターでの検出

MitoBright LT Green


Ex: 488 nm
Em: 515 nm–545 nm

MitoBright LT Red


Ex: 488 nm
Em: 564 nm–604 nm

MitoBright LT Deep Red


Ex: 633 nm
Em: 650 nm–670 nm

Jurkat 細胞(3.2 x 105 cells/mL) をRPMI 培地 (10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin) で 5 cm ディッシュに播種し、37℃、5% CO2 インキュベーター内で一晩培養した。
培地を取り除き、MitoBright LT working solution (0.1 μmol/L, 5 mL) を添加し37℃ で30 分間インキュベートした。溶液を取り除き、5 mL のRPMI 培地を用いて2 回洗浄した。
RPMI 培地を添加し、細胞培養を継続し、その細胞を2 日毎にフローサイトメーターで解析した。

ラインナップと各試薬の蛍光特性

MitoBright LT Green


励起波長(λex) : 493 nm
蛍光波長(λem) : 508 nm

 

MitoBright LT Red


励起波長(λex) : 548 nm
蛍光波長(λem) : 564 nm

 

MitoBright LT Deep Red


励起波長(λex) : 644 nm
蛍光波長(λem) : 666 nm

 

使用回数の目安

MitoBright LT 容量 蛍光顕微鏡 フローサイトメーター
(working solution1 ml使用した場合)
(35 mm dish,  working solution 
2 ml/dish使用した場合)
400 μl 200 枚 400 回

 *100 nmol/l MitoBright LT working solutionを調製した場合。

参考文献

参考文献を表示する

文献No. 対象サンプル 装置 引用(リンク)
1 細胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7; HCT-116 ) 蛍光顕微鏡 L. Zhou, Q. Guan, W. Li, Z. Zhang, Y. Li and Y. Dong, "A Ferrocene-Functionalized Covalent Organic Framework for Enhancing Chemodynamic Therapy via Redox Dyshomeostasis", 2021, doi:10.1002/smll.202101368.
2 細胞 (HT-1080; MCF-10A; MCF-7 ) 蛍光顕微鏡 Q. Guan, L. Zhou, Y. Dong, "Construction of Nanoscale Covalent Organic Frameworks via Photocatalysis-Involved Cascade Reactions for Tumor-Selective Treatment", 2021, doi:10.1002/adtp.202100177.
3 細胞 (4T1) 蛍光顕微鏡 X. Chen, X Yin, L. Zhan, J. Zhang, Y. Zhang, Y. Wu, J. Ju, Y. Li, Q. Xue, X. Wang, C. Li, R. R. L. Reis and Y. Wang, "Organelle-Specific Anchored Delivery System Stretching a Reversal of Tumor Hypoxia Microenvironment to a Combinational Chemo-Photothermal Therapy", 2021, doi:10.1002/adfm.202108603.
4 細胞 (SW982) 蛍光顕微鏡 S. Xia, Z. Ma, B. Wang, F. Gao, C. Yi, X. Zhou, S. Guo, L. Zhou, "In vitro anti-synovial sarcoma effect of diallyl trisulfide and mRNA profiling", 2021, doi:10.1016/j.gene.2021.146172.
5 細胞 (AIG-1) 蛍光顕微鏡 Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, "Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts", 2022, doi:10.1016/j.exger.2022.111866.

よくある質問

Q

MitoBright LT は DMSO溶液ですが、凍結融解を繰り返しても劣化しないのでしょうか?

A

小社では凍結融解を30回繰り返した溶液を用いて、染色が可能であったことを確認しております。

Q

MitoBright LTとMitoBrightの違いを教えてください。

A

MitoBright LTはMitoBrightの細胞内滞留性を高めた製品です。また、MitoBright LTはDMSOに溶解した製品であり、染色溶液を調製する手間がなくすぐにお使い頂けます。その他の性能の違いは下記表をご参照ください。

Q

MitoBright LTシリーズで染色した後に脱分極すると、染色度合いに影響はありますか?

A

脱分極条件や細胞種などにより影響は確認されます。また、MitoBright LTの各色素で影響の度合は異なります。
参考として小社ではHeLa細胞を各MitoBright LTで染色し、下記条件にて脱分極処理を行って蛍光染色の変化を観察しました。 

<染色条件>
HeLa細胞をMitoBright LT (100 μmol/l、30分インキュベーション)にて染色しHBSSにて洗浄後
FCCP処理(100μmol/l 、60分インキュベーション)しHBSSにて2回洗浄後観察した。

 

    <検出条件>
     MitoBright LT Green       :Ex 488 nm/Em 500–560 nm
     MitoBright LT Red          :Ex 561 nm/Em 560–620 nm
     MitoBright LT Deep Red  :Ex 640 nm/Em 650–700 nm

取扱条件

規格
性状: 本品は、青色液体である。
吸光度: 0.300~0.500(650 nm付近)
取扱条件
保存条件: 冷凍,遮光
危険・有害
シンボルマーク
健康有害性
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