05 細胞染色用色素

MitoBright LT Deep Red

ミトコンドリア染色用色素 Deep Red

長時間細胞に滞留する
血清培地中で染色できる
蛍光顕微鏡・フローサイトメーターに対応

製品コード

MT12　 MitoBright LT Deep Red

容　量	本体価格
20 μl	￥6,000
400 μl	￥12,000
400 μl x 3	￥30,000

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ミトコンドリア染色：MitoBright LT Green、マイトファジー染色：Mtphagy Dye
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試験成績書

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性質

ミトコンドリアは細胞内のエネルギー生産のみならずさまざまな細胞機能に関与する多機能なオルガネラであり、活発な融合と分裂サイクルによりその形態を変化させています。これはミトコンドリアダイナミクスと言われ、最近では、ミトコンドリアの形態制御異常が神経変性疾患、代謝疾患や老化などに関与することからミトコンドリアの動態を長期間観察する需要が増えています。

ミトコンドリア関連研究用試薬の比較関連製品の特徴を一覧でご紹介

マニュアル

技術情報

MitoBright LT は、他とココが違う

長時間細胞に滞留する

HeLa 細胞をHBSS にて洗浄後、各MitoBright LT または既存試薬にて染色し、血清入り培地に入れ替え、4 日間培養後ミトコンドリアを観察しました。その結果、既存試薬は蛍光強度が4 日後に大きく低下したのに対し、 MitoBright LT は蛍光強度が維持され、ミトコンドリアを明瞭に観察できました。さらに継続して培養を行った結果、 MitoBright LT は7 日後もミトコンドリアに滞留していることが確認されました。

＜検出条件＞
MitoBright LT Green 、既存試薬（T 社）Green	：Ex 488 nm/Em 500–560 nm
MitoBright LT Red 、既存試薬（T 社）Red	：Ex 561 nm/Em 560–620 nm
MitoBright LT Deep Red 、既存試薬（T 社）Deep Red	：Ex 640 nm/Em 650–700 nm

血清入りの培地で染色できる

MitoBright LT と既存試薬にて、血清有無の培地で染色しました。既存試薬は血清入り培地で染色した場合、蛍光が暗くなるのに対し、MitoBright LT は血清入り培地中で染色しても蛍光強度が低下することがなく、ミトコンドリアを明瞭に染色しました。

ミトコンドリアの分裂と融合の様子

HeLa細胞をMitoBright LT Deep Redにて染色後、血清入り培地に入れ替えミトコンドリアの形態を30分間観察しました。

＜測定装置＞
共焦点レーザー顕微鏡、倍率　63倍

＜観察条件＞
Ex 640 nm、Em 650-700 nm

超解像レーザー顕微鏡(STED)によるミトコンドリア内部構造の観察

ミトコンドリア病の原因変異を有するサイブリッド細胞を、MitoBright LT Deep Redにて染色し超解像レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、ミトコンドリアのクリステ構造の異常が確認されました。

コントロールサイブリッド細胞 ミトコンドリア病の原因変異を有するサイブリッド細胞

＜実験条件＞
色素：MitoBright LT Deep Red (100 nmol/l)
装置：Leica 超解像レーザー顕微鏡TCS SP8 STED 3X
Ex. 640 nm / Em. 650-700 nm
STEDレーザー：775 nm

＜実験手順＞
1. ガラスベースディッシュに細胞を播種し、インキュベーター（37℃、5% CO₂）内で2日間培養。
2. 培地を取り除き、L-15培地（10% FBS含有）で調製したMitoBright LT Deep Red (100 nmol/l）を添加。
3. インキュベーター（37℃、5% CO₂）内で45分間インキュベート。
4. 上澄みを取り除き、HBSSで2回洗浄。
5. L-15培地（10%FBS含有）を添加し、超解像レーザー顕微鏡（Leica TCS SP8 STED 3X）で観察。

※本データは、東京都健康長寿医療センター研究所　老化制御研究チーム　大澤郁朗様、藤田泰典様よりご提供頂きました。

コラーゲンコートプレートを用いたミトコンドリア検出

ミトコンドリアの形態評価は高倍率で観察するため、コラーゲンコートしたガラスプレートがよく使用されます。
既存のミトコンドリア染色試薬は、コラーゲンに吸着しバックグラウンドを上昇させる問題がありましたが、MitoBright LTシリーズはバックグラウンドの影響がなく鮮明にミトコンドリアを染色できます。

MitoBright LT Deep Red	既存試薬（MitoBright Deep Red）
	スケールバー: 50 μm

＜染色条件＞
HeLa細胞をコラーゲンコートプレートに播種し、24時間培養後　上澄みを抜き取り、HBSS にて洗浄した。
100 nmol/l MitoBright LT Deep Red working solution を添加し30分インキュベート後上澄みを抜き取り、HBSS にて洗浄し蛍光顕微鏡で観察した。

＜観察条件＞
Ex 640 nm, Em 650–700 nm

＜結果＞
既存試薬はバックグラウンドが見られましたが、MitoBright LTで染色したミトコンドリアはバックグラウンドの影響がなく、鮮明にミトコンドリアを染色しました。

フローサイトメーターでの検出

Jurkat 細胞(3.2 x 10⁵ cells/ml) をRPMI 培地 (10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin) で 5 cm ディッシュに播種し、37℃、5% CO₂ インキュベーター内で一晩培養した。
培地を取り除き、MitoBright LT working solution (0.1 μmol/l, 5 ml) を添加し37℃ で30 分間インキュベートした。溶液を取り除き、5 ml のRPMI 培地を用いて2 回洗浄した。
RPMI 培地を添加し、細胞培養を継続し、その細胞を2 日毎にフローサイトメーターで解析した。

ラインナップと各試薬の蛍光特性

使用回数の目安

MitoBright LT 容量	蛍光顕微鏡	フローサイトメーター (working solution1 ml使用した場合)
MitoBright LT 容量	（35 mm dish, working solution 2 ml/dish使用した場合)	フローサイトメーター (working solution1 ml使用した場合)
20 μl	10 枚	20 回
400 μl	200 枚	400 回
400 μl x 3	600 枚	1200 回

*100 nmol/l MitoBright LT working solutionを調製した場合。

よくある質問

Q MitoBright LT は DMSO溶液ですが、凍結融解を繰り返しても劣化しないのでしょうか？: A

小社では凍結融解を30回繰り返した溶液を用いて、染色が可能であったことを確認しております。

Q MitoBright LTとMitoBrightの違いを教えてください。: A

MitoBright LTはMitoBrightの細胞内滞留性を高めた製品です。また、MitoBright LTはDMSOに溶解した製品であり、染色溶液を調製する手間がなくすぐにお使い頂けます。その他の性能の違いは下記表をご参照ください。

Q MitoBright LTシリーズで染色した後に脱分極すると、染色度合いに影響はありますか？: A

脱分極条件や細胞種などにより影響は確認されます。また、MitoBright LTの各色素で影響の度合は異なります。
参考として小社ではHeLa細胞を各MitoBright LTで染色し、下記条件にて脱分極処理を行って蛍光染色の変化を観察しました。

＜染色条件＞
HeLa細胞をMitoBright LT (100 μmol/l、30分インキュベーション)にて染色しHBSSにて洗浄後
FCCP処理(100μmol/l 、60分インキュベーション)しHBSSにて2回洗浄後観察した。

＜検出条件＞
MitoBright LT Green :Ex 488 nm/Em 500–560 nm
MitoBright LT Red :Ex 561 nm/Em 560–620 nm
MitoBright LT Deep Red :Ex 640 nm/Em 650–700 nm