01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

細胞毒性測定キット

  • 優れたコストパフォーマンス
  • 冷蔵で6ヶ月保存可能なWorking Solution
  • 1つのキットで、ホモジニアス測定、ノンホモジニアス測定の選択が可能
  • 製品コード
    CK12  Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST
容 量 本体価格
100 tests ¥9,600
500 tests ¥25,400
2000 tests ¥38,000
キット内容
100 tests ・Dye Mixture
・Assay Buffer
・Lysis Buffer
・Stop Solution
×1
11 mL×1
1.1 mL×1
5.5 mL×1
500 tests ・Dye Mixture
・Assay Buffer
・Lysis Buffer
・Stop Solution
×1
55 mL×1
5.5 mL×1
27.5 mL×1
2000 tests ・Dye Mixture
・Assay Buffer
・Lysis Buffer
・Stop Solution
×1
55 mL×4
5.5 mL×4
27.5 mL×4

背 景

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTは、細胞から培地中に放出された乳酸脱水素酵素(LDH)活性を測定することにより細胞傷害を測定するキットである。
LDHは細胞質に存在する酵素で、通常は細胞質に留まっているが、細胞膜が傷害を受けると培地中に放出される。放出されたLDHは安定なので、死細胞または細胞膜に傷害を受けた細胞数を測る指標として広く測定されている。LDHは、NAD(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を補酵素として乳酸の脱水素化を触媒し、ピルビン酸とNADHを生成する。生じたNADHは、電子メディエーターを介してテトラゾリウム塩(無色)をホルマザン(橙色)に還元する。生成したホルマザンの量は、放出されたLDH活性に比例するため、傷害を受けた細胞数の指標となる。

原 理

本キットは、生細胞と反応せず、かつ、細胞にダメージを与えないため、生細胞と死細胞が混在する細胞培養液中に直接試薬を加えても細胞傷害を測定することが可能である(ホモジニアスアッセイ)。なお、一般的に用いられる細胞培養液を取り出してLDH活性を測定する方法も可能である(ノンホモジニアスアッセイ)。また、安定性の高い試薬を用いているため、調製した溶液は長期間保存でき、用時調製する必要がない。そのため、多検体アッセイから、少ない検体数の測定にも対応することができる。

コンセプト

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTは、細胞から培地中に放出された乳酸脱水素酵素(LDH)活性を測定することにより細胞傷害を測定するキットである

パンフレット

開発元 Dojindo Molecular Technologies, Inc.

技術情報

測定方法の選択

細胞培養液に直接試薬を添加するホモジニアスアッセイと、細胞培養液の上清を使うノンホモジニアスアッセイのいずれの方法でも測定が可能である。実験状況に応じて測定方法を選択することができる。

Working Solution調液後の安定性評価

死細胞測定に使用するWorking Solutionは、簡単な操作で調製することができ、6ヶ月間冷蔵で保存することができる。Working Solutionが安定なため、試薬の無駄を減らすことができる。

測定例
Cell Counting Kit-8 とCytotoxicity LDH Assay Kit-WST を併用した細胞毒性試験

試験物質 Mitomycin C
細胞 HeLa
使用培地 MEM, 10% FBS
インキュベート 37℃, 5% CO2, 48時間
検出波長 Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (490 nm)

HeLa 細胞にMitomycin C を添加した際の細胞毒性をCell Counting Kit-8 [Code: CK04]とCytotoxicity LDH Assay Kit-WSTを用いて測定した。
Cell Counting Kit-8による細胞内代謝活性を指標とした方法とCytotoxicity LDH Assay Kit-WSTを用いた細胞膜損傷による遊離LDHを指標とした方法では各々の指標が異なるため、細胞毒性が現れる薬剤濃度に違いがあることが確認された。

試験物質 Mitomycin C
細胞 HeLa
使用培地 MEM, 10% FBS
インキュベート 37℃, 5% CO2, 48時間
検出波長 Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (490 nm)
測定例
RAJI細胞を用いたCDC試験
(Complement-Dependent Cytotoxicity : 補体依存性細胞毒性)

抗体濃度に依存して吸光度が増加していることから、細胞への抗CD20抗体の結合により補体系が活性化され、細胞傷害が起こったことが確認された。

技術や使用製品に関する補足

細胞毒性の選択

サンプル 細胞毒性イメージ 実験系 プロトコル
薬剤
Drug
薬剤依存性細胞毒性
(Drug-Dependent Cytotoxicity)
プロトコル
補体
Complement
補体依存性細胞毒性
CDC (Complement-Dependent Cytotoxicity)
プロトコル
P11に記載
抗体/免疫細胞
Antibody/ Immune cell
抗体依存性細胞毒性
ADCC (Antibody-Dependent Cell mediated Cytotoxicity)
プロトコル
CAR-T 細胞
CAR-T cell

CAR-T細胞依存性毒性
(CAR -T cell mediated Cytotoxicity)

CAR:Chimeric Antigen Receptor (キメラ抗原受容体)
プロトコル
(英文)

抗がん剤ドキソルビシン(DOX)による細胞毒性メカニズム

近年、細胞毒性評価の際に併せて抗酸化能に関与する指標 (NADP+/NADPHやGSSG/GSH等)を測定するケースが増えています。
本項目では抗酸化能の低下が細胞毒性発現に関与するDOXの例をご紹介します。

参考文献

参考文献を表示する

文献No. 対象サンプル 引用(リンク)
1) 細胞
(C3H10T1/2)
S. F. Jin, H. L. Ma, Z. L. Liu, S. T. Fu, C. P Zhang, Y. He, "XL413, a cell division cycle 7 kinase inhibitor enhanced the anti-fibrotic effect of pirfenidone on TGF-β1-stimulated C3H10T1/2 cells via Smad2/4."Exp Cell Res., 2015, 339, (2), 289.
2) 細胞
(HepG2)
S. Watanabe, C. S. Moniaga, S. Nielsen, M. Hara-Chikuma, "Aquaporin-9 facilitates membrane transport of hydrogen peroxide in mammalian cells."Biochem Biophys Res Commun ., 2016, 471, 191.
3) 細胞
(HEECs, Human Esophageal Epithelial Cells)
L. Wu, T. Oshima, J. Shan, H. Sei, T. Tomita, Y. Ohda, H. Fukui, J. Watari, H. Miwa , "PAR-2 activation enhances weak acid-induced ATP release through TRPV1 and ASIC sensitization in human esophageal epithelial cells."Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol ., 2015, 309, G695.
4) 細胞
(Human L02 Hepatocyte)
D. Zhou, B-H Li, J. Wang, Y-N Ding, Y. Dong, Y-W Chen and J-G Fan, "Prolyl Oligopeptidase Inhibition Attenuates Steatosis in the L02 Human Liver Cell Line."PloS ONE., 2016, 11, (10), e0165224.
5) 細胞
(Human primary Hepatocyte)
T. Fukami, A. Iida, K. Konishi, M. Nakajima , "Human arylacetamide deacetylase hydrolyzes ketoconazole to trigger hepatocellular toxicity"Biochem. Pharmacol., 2016, 116, 153.
6) 細胞
(Mouse embryonic fibroblast:MEF)
Y. Takanezawa, R. Nakamura, Y. Sone, S. Uraguchi and M. Kiyono, "Atg5-dependent autophagy plays a protective role against methylmercury-induced cytotoxicity"Toxicol. Lett., 2016, 262, 135.
7) 細胞
(neural stem/progenitor cells)
M. Tanaka, M. Yoneyama, T. Shiba, T. Yamaguchi, K. Ogita, "Protease-activated receptor-1 negatively regulates proliferation of neural stem/progenitor cells derived from the hippocampal dentate gyrus of the adult mouse "J Pharmacol Sci., 2016, 131, (3), 162
8) 細胞
(Primary cultured cortical neurons)
S. Wakatsuki, A. Furuno, M. Ohshima, and T. Araki, "Oxidative stress-dependent phosphorylation activates ZNRF1 to induce neuronal/axonal degeneration"J Cell Biol., 2015, 211, (4), 881.
9) 細胞
(DLD1 and AGS cells)
A. Ishijima, K. Minamihata, S. Yamaguchi, S. Yamahira, R. Ichikawa, E. Kobayashi, M. Iijima, Y. Shibasaki, T. Azuma, T. Nagamune & I. Sakuma, "Selective intracellular vaporisation of antibody-conjugated phase-change nano-droplets in vitro"Scientific Reports ., 2017, DOI:10.1038/srep44077.
10) 細胞
(U87, HUVEC cell)
N. Li, W. Zhang, M. Khan, L. Lin, JM. Lin, "MoS2-LA-PEI nanocomposite carrier for real-time imaging of ATP metabolism in glioma stem cells co-cultured with endothelial cells on a microfluidic system"Biosens Bioelectron., 2017, 99, (2018), 142.
11) 組織
(マウス肝臓)
Y. Sakurai, W. Mizumura, M. Murata, T. Hada, S. Yamamoto, K. Ito, K. Iwasaki, T. Katoh, Y. Goto, A. Takagi, M. Kohara, H. Suga, and H. Harashima, "Efficient siRNA delivery by lipid nanoparticles modified with a non-standard macrocyclic peptide for EpCAM-targeting"Mol. Pharm.., 2017,10.1021/acs.molpharmaceut.7b00362.
12) 細胞
(Human pleural mesothelial cell)
K. Hattori, K. Nakadate, A. Morii, T. Noguchi, Y. Ogasawara, K. Ishii., "Exposure to nano-size titanium dioxide causes oxidative damages in human mesothelial cells: The crystal form rather than size of particle contributes to cytotoxicity."Biochem. Biophys. Res. Commun.., 2017,10.1016/j.bbrc.2017.08.054.
13) 組織
(murine distal colon)
H. Sakai, S. Tabata, M. Kimura, S. Yabe, Y. Isa, Y. Kai, F. Sato, T. Yumoto, K. Miyano, M. Narita and Y. Uezono, "Active Ingredients of Hange-shashin-to, Baicalelin and 6-Gingerol, Inhibit 5-Fluorouracil-Induced Upregulation of CXCL1 in the Colon to Attenuate Diarrhea Development"Biol. Pharm.Bull.., 2017, 40, (12), 2134.
14) 細胞
(SH-SY5Y cell)
R. Watanabe, T. Kurose, Y. Morishige and K. Fujimori, "Protective Effects of Fisetin Against 6-OHDA-Induced Apoptosis by Activation of PI3K-Akt Signaling in Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells."Neurochem. Res.., 2018, 43, (2), 488-499.
15) 細胞
(MC3T3-E1[マウス頭蓋冠由来])
A. Oyane, M. Nakamura, I. Sakamaki, Y. Shimizu, S. Miyata and H. Miyaji, "Laser-assisted wet coating of calcium phosphate for surface-functionalization of PEEK", PLoS ONE ., 2018, doi:10.1371/journal.pone.0206524.
16) 細胞
CRC細胞 [大腸がん]、HT29細胞[ヒト結腸腺癌]
T. Fuji, Y. Umeda, A. Nyuya, F. Taniguchi, T. Kawai, K. Yasui, T. Toshima, K. Yoshida, T. Fujiwara, A. Goel and T.Nagasaka, "Detection of Circulating MicroRNAs with Ago2 Complexes to Monitor the Tumor Dynamics of Colorectal Cancer Patients during Chemotherapy.", Int. J. Cancer., 2018, doi: 10.1002/ijc.31960 .
17) 細胞
(SFXN2ノックアウトHEK293)
E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, "Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 ", J Physiol Sci., 2018, doi:10.1007/s12576-018-0652-2.
18) 細胞
(Human umbilical vein cell line [EA.Hy926])
Y. Xu, C. Huang, M. Liu, N. Chen, W. Chen, C. Yang, Y. Zhao, X. Li, J. Duan, S. Liu and S. Yang, "Survivin regulated by autophagy mediates hyperglycemia-induced vascular endothelial cell dysfunction", Exp. Cell Res.., 2018, doi: 10.1016/j.yexcr.2018.01.037.
19) 細胞
(MIAPaCa-2[ヒト膵臓がん])
M. Akimoto, R. Maruyama, Y. Kawabata, Y. Tajima and K. Takenaga, "Antidiabetic adiponectin receptor agonist AdipoRon suppresses tumour growth of pancreatic cancer by inducing RIPK1/ERKdependent necroptosis", Cell Death Dis., 2018, 9, 804.

よくある質問

Q

490 nm以外の吸収フィルターで測定できますか?

A

弊社では490 nmを推奨していますが、490±2-3 nm程度の違いは問題ありません。490 nm以外では、450 nmのフィルターは弊社でも使用実績があり、使用可能です。但し、吸光度値は490 nmと比較し高くなります。

Q

毒性試験でCell Counting Kit-8との相関性はありますか?

A

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTとCell Counting Kit-8では、測定原理が異なるために必ずしも相関性は得られません。そのため、細胞毒性試験の場合には、遊離LDH測定法とCell Counting Kit-8など数種の指標で測定いただくことをお勧めします。
・Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST:細胞膜の損傷により培地中に漏れ出したLDH活性を測定(細胞膜損傷が指標)
・Cell Counting Kit-8:細胞内の代謝活性(デヒドロゲナーゼ)を測定(代謝活性が指標)

Q

LD50値が過去の測定値と大きく異なります。なにか対処法はありますか?

A

・細胞の状態によって、被験物質による影響の受け方が変わりLD50値に影響します。ご使用になる細胞は、継代条件や継代回数をコントロールし、可能な限り同じ状態の細胞をお使い下さい。
・被験物質の希釈系列を調製する際の希釈倍率を狭くすることで、より信頼性の高いLD50値を導き出すことができます。
下記の要領で、使用する被験物質濃度を設定されることをおすすめします。

検討の流れ

① 被検物質が利用できる最高濃度を基準に10倍希釈を繰り返し、5-6桁程度の広い検体濃度域で毒性試験を実施する。[図①]
(①の操作で、毒性が現れる濃度域の予測最高濃度の目安をつける)
② ①の結果から、その被検物質の濃度が現れる濃度の予測最高濃度(100%致死を生じる最低濃度)を基準に2倍希釈を繰り返し、2-3桁をカバーする濃度域で毒性試験をする。[図②]
③ ②の手順を繰り返し、最終的に細胞毒性が20-80%の間に少なくとも検体濃度が3点以上プロットできる濃度域を設定する。[図③]

Q

LDHのアイソザイムの測り分けはできますか?

A

本製品は、トータルのLDH活性を指標とした細胞毒性測定用となりますので、LDH1, LDH2, LDH3等の活性の測り分けはできません。

Q

LDHはどの程度安定ですか?

A

以下のような報告例があります。
培地中でのLDH活性の低下は1日で5%以下(文献1)、また、冷蔵保存では約1週間は安定と報告されています(文献2)。なお、安定性は評価条件等により変化する可能性があります。
ご理解の上、下記論文をご参考ください。

文献1:
A. Wagner, A. Marc, JM. Engasser, A. Einsele, "The use of lactate dehydrogenase (LDH) release kinetics for the evaluation of death and growth of mammalian cells in perfusion reactors.", Biotechnol Bioeng199239, (3), :320..
文献2:
M. Allen, P. Millett, E. Dawes, N. Rushton., "Lactate dehydrogenase activity as a rapid and sensitive test for the quantification of cell numbers in vitro.", Clin Mater199416, (4), 189.

Q

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTにLDH標準品は入っていますか?

A

細胞毒性試験用のため、LDH標準品は同梱しておりません。LDH活性も測定する場合は、別途、お買い求めください。

Q

Stop solution添加後すぐに測定する必要はありますか?

A

Stop solution添加後、3時間以内に測定してください。その場合は、プレートを遮光してください。

Q

ウェル間でバラツキが多いのですが何が原因でしょうか?

A

以下の要因が考えられますので、ご確認ください。

①培地の表面に気泡が発生している。

以下の方法で気泡を除去してください。
・シリンジや注射針の先端で、気泡を除去してください。
・(96wellプレート用遠心機をお持ちの場合)1,000 x g, 1分間遠心してください。

②インキュベーション中に培地の水分が蒸発して試薬濃度が変化している。

マイクロプレートの一番外側のウェルは、インキュベーション中の水分蒸発が起こりやすいため、長時間インキュベーションする場合は、一番外側のウェルは測定には利用せず、培地のみを入れて使用してください。

③試薬を添加する際に、最初と最後に添加するウェルの時間差が大きい。

全てのウェルに添加するWorking Solution、Stop Solutionについては、マルチチャンネルピペットのご使用をお勧めします。

④添加した試薬がよく混合されていない。

Lysis Buffer, Working Solution およびStop Solutionを添加した際、プレートミキサーで混合するか、または、プレートの側面を指で軽く叩いて添加した試薬と培地を混和してください。
特に、Lysis Bufferは添加量が少なく、高コントロールの値に影響を与えるため、ご注意ください。
なお、プレートを叩く際は、ウェル中の培地が漏れ出さない程度にしてください。

⑤使用する(マルチチャンネル)ピペットの秤量が正確ではない。

ピペットの秤量が正確か確認してください。

Q

バックグラウンドが高くなりました。原因や対策を教えてください。

A

以下の原因が考えられます。
①培地中の血清に含まれるLDHはバックグラウンドを上げます。無血清培地または血清量を5%以下となるように調製した培地をご使用下さい。
②被検物質や培地中に強い還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色してバックグラウンドを上げます。試薬ブランクを測定して確認してください。
(なお、一般的なDMEM、RPMI、F-12等の培地には、通常、還元物質は含まれていません)

Q

細胞数最適化時の高コントロールと低コントロールの吸光度の差が小さい

A

①バックグラウンドが高いために低コントロールの吸光度が高くなっている可能性があります。以下を確認してください。

・培地中の血清に含まれるLDHはバックグラウンドを上げます。無血清培地または血清量を5%以下となるように調製した培地をご使用下さい。
・被検物質や培地中に強い還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色してバックグラウンドを上げます。試薬ブランクを測定して確認してください。

②高コントロールに生細胞が残っている可能性があります。

Lysis Bufferがウェル内で均一になり細胞が全て死細胞となるように、Lysis Buffer添加後にプレートを軽く振りLysis Bufferが十分に混ざるようにしてください。

取扱条件

取扱条件
1.保存方法:冷蔵,遮光
PRTR法 第1種指定化学物質
危険・有害
シンボルマーク
感嘆符腐食性

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