細胞外で凝集しない ExoSparkler シリーズ

Mem Dye-Deep Red または製品P（緑または赤）で染色したエクソソームをHeLa 細胞へ添加し、細胞内へ取り込まれるエクソソームを蛍光顕微鏡で確認しました。その結果、製品P（緑または赤）で染色したエクソソームにおいては、色素の凝集が疑われる細胞外の蛍光輝点が確認されました。

■　実験条件 超遠心法で精製したエクソソーム（タンパク質量として 10 μg）を各色素で染色し、HeLa細胞（1.25×104 cells）に添加、24 時間インキュベートし、洗浄後の蛍光画像を観察した。 ■　観察条件 Mem Dye-Deep Red（紫）:　Ex 640 nm / Em 640-760 nm S 社 製品P（緑）:　Ex 488 nm / Em 490-540 nm S 社 製品P（赤）:　Ex 561 nm / Em 570-640 nm

また、Mem Dye-Deep Red または製品P（緑または赤）の色素溶液をNTA（ナノ粒子トラッキング解析）で確認した結果、Mem Dye-Deep Red では色素の凝集物が確認できなかったのに対して、製品P（緑または赤）では色素の凝集が疑われる100-500 nmの粒子が観察されました。

※測定装置：LM10-HSBFT 14 (Nanosight社製）

　　　Mem-Dye溶液ならびに製品P溶液の粒子径変化

なお、Mem Dye-Green, Red においても、Mem Dye-Deep Red と同様に色素の凝集は確認されませんでした。

エクソソームの性質にほとんど影響しない

Mem Dye-Deep Red または製品P（緑または赤）で染色する前後のエクソソームについて、NTA(ナノ粒子トラッキング解析)とゼータ電位を測定することで、染色によるエクソソームの変化を確認しました。

その結果、Mem-Dyeシリーズ（Green、Red、Deep Red）は、エクソソームの性質にほとんど影響を及ぼさないことが確認されました。

エクソソームの粒子径に対する影響
Mem-Dyeシリーズ（Green、Red、Deep Red）ならびに製品P（緑、赤）の各10 µmol/l DMSO溶液を調製し、10 ug（タンパク質量として） のエクソソームを染色後にNTA(ナノ粒子トラッキング解析)を行いました。

結果としてMem-Dyeシリーズで染色したエクソソームは未染色のエクソソームに対して、粒子数ならびに粒子径への影響がほとんど見られませんでしたが（下図左）、製品Pによる染色前後では粒子数と粒子径に顕著な変化がみられました（下図右）。
※測定装置：LM10-HSBFT 14 (Nanosight社製）

　　　　　Mem-Dyeによる染色前後のNTA比較　　　　　　　　　製品Pによる染色前後のNTA比較

エクソソームの膜電位に対する影響
Mem-Dyeシリーズ（Green、Red、Deep Red）ならびに製品P（緑、赤）の各10 µmol/l DMSO溶液を調製し、10 ug（タンパク質量として） のエクソソームを染色後にゼータ電位を測定しました。

結果として、Mem-Dyeシリーズで染色したことによるゼータ電位の変化は、製品Pで染色した場合と比較して小さくなることを確認しました。
※測定装置：Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical社製）

　　　　　Mem-Dyeシリーズならびに製品Pによる染色前後のゼータ電位比較

参考文献) T. Shimomura, R. Seino, K. Umezaki, A. Shimoda, T. Ezoe, M. Ishiyama, and K. Akiyoshi., "New Lipophilic Fluorescent Dyes for Labeling Extracellular Vesicles: Characterization and Monitoring of Cellular Uptake", BIOCONJUGATE CHEM., 2021, doi:10.1021/acs.bioconjchem.1c00068.

このキットだけで蛍光標識から精製まで

ExoSparkler シリーズは、エクソソームの標識に最適化したプロトコルに加え、蛍光標識後の未反応色素を除去できるフィルトレーションチューブを同梱しているため、簡単な操作で蛍光標識エクソソームを調製できます。

精製手法(未反応色素の除去)の比較

ExoSparklarシリーズで未反応色素の除去に使用しているフィルトレーションチューブは、同用途で従来から用いられているゲルろ過法と比較して、高い回収率でエクソソームを精製することが可能です。

フィルトレーションチューブを用いた精製の有効性確認の蛍光画像をよくある質問：標識後の精製操作でフィルターは着色していますが、未反応の色素は分離できていますか？に掲載しています。

豊富なラインナップ

■　実験条件 超遠心法で精製したエクソソーム（タンパク質量として 10 μg）を各色素で染色し、HeLa細胞（1.25×104 cells）に添加、24 時間インキュベートし、洗浄後の蛍光画像を観察した。 ■　観察条件 Green：Ex 488 nm / Em 490 - 540 nm Red　：Ex 561 nm / Em 570 - 640 nm Deep Red ：Ex 640 nm / Em 640 - 760 nm

実験例：時間依存的なエクソソームの局在変化

■　実験条件

超遠心法で精製したエクソソーム(タンパク質量として10 µg)をMem Dye-Deep Red(エクソソーム膜蛍光染色キット)で染色し、リソソーム染色試薬で染色したHeLa細胞(1.25×10⁴ cells)に添加、1時間後ならびに4時間後の蛍光画像を観察した。

結果、時間の経過に伴いMem Dye-Deep Redの蛍光輝点(紫)はリソソームの局在(緑)と重なり(白)、時間依存的にエクソソームの局在が変化している様子が確認された。

Mem Dye-Deep Red(紫)とリソソーム染色試薬(緑)の共染色 ■　観察条件 Mem Dye-Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm リソソーム染色試薬： Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm

実験例：エンドサイトーシス経路を介したエクソソーム取り込みの可視化

時間依存的なエンドサイトーシスによるエクソソーム取り込みの様子を可視化しました。結果、ECGreen（製品コード：E296）とMem Dye-Deep Redで染色したエクソソームの時間依存的な集積による蛍光強度の増加が確認でき、共局在を示す白色輝点が増加していることが確認出来ました。この結果より、エクソソームはエンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれることが示唆され、エクソソーム本来の挙動を示していることが確認できました。

＜観察条件>
エンドソーム（ECGreen、緑）： Ex. 405 nm / Em. 500 - 560 nm
エクソソーム（Mem Dye-Deep Red、紫）：Ex 640 nm / Em 640-760 nm
スケールバー：10 µm

<実験操作>
(1) HeLa細胞に10% FBS含有MEM培地で希釈した10 µmol/l ECGreenを加え30分インキュベーション
(2) 洗浄せずに、Mem Dye-Deep Redで染色したエクソソーム(10 µgタンパク質相当量)をHeLa細胞に添加
(3) 各サンプルをインキュベーション (30分、120分)
(4) 各時間毎サンプルを洗浄し、細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察