01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

DAPGreen - Autophagy Detection

DAPGreen - Autophagy Detection

オートファジー(オートファゴソーム)の検出試薬

  • 製品コード
    D676  DAPGreen - Autophagy Detection
容 量 本体価格
5 nmol ¥36,000

性質

オートファゴソームで見るオートファジー
DAPGreenは、細胞内の不要なタンパク質・細胞小器官などの再利用や、代謝のための分解過程であるオートファジーを培養細胞に試薬を添加するだけで簡便に検出できる蛍光色素です。オートファジーマーカーのLC3を指標とした検出法とも高い相関性が得られています。

マニュアル

はじめての抗体標識プロトコル

死細胞数を測りたい(吸光測定)

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST を用いた細胞毒性試験の例を紹介

お役立ち情報

技術情報

原理

オートファゴソーム膜が形成される際に、DAPGreenは膜内に取り込まれ、脂溶性環境下に応答し蛍光が増大します。なお、オートファジーマーカーのLC3 を指標とした検出法とも高い相関性が得られています。

操作は試薬の添加だけ

遺伝子導入が不要。準備した細胞に試薬を添加するだけの簡単操作で蛍光イメージングを実現できます。

検出試薬の概要

蛍光顕微鏡だけでなくフローサイトメーターでも検出頂けます。またDAPGreenでは、プレートリーダーによる検出も実現しました。ご使用の装置で検出可能な蛍光特性をご確認の上、ご使用ください。

  対応装置 蛍光特性 容量 / 使用回数
の目安
既存検出法
蛍光顕微鏡 フローサイト
メーター
プレート
リーダー
DAPGreen Ex. 425-475
Em. 500-560
※ 共焦点顕微鏡では
488 nmにて励起可能
5 nmol x 1 /
35 mm dish: 25枚分
(0.1 μmol/Lで使用時)
LC3-GFP
MDC
Cyto-ID など
DAPRed
(オートファゴソーム検出)
× × Ex. 500-560 nm
Em. 690-750 nm
5 nmol x 1 /
35 mm dish: 25枚分
(0.1 μmol/Lで使用時)
DALGreen
(オートリソソーム検出)
× Ex. 350-450
Em. 500-560
※ 共焦点顕微鏡では
488 nmにて励起可能
20 nmol x 1 /
35 mm dish: 10枚分
(1.0 μmol/Lで使用時)
LC3-GFP-RFP
など

※ DAPGreenとDALGreenの共染色イメージングはできません。

LC3との高い相関

オートファジーマーカーであるLC3を指標とした検出法と共染色を行い局在の比較を行った。


検出条件
DAPGreen:Ex. 488 nm / Em. 500-563 nm
スケールバー :10 μm

RFP-LC3発現Hela細胞にDAPGreen添加後、Rapamycinによりオートファジーを誘導しました。誘導から4時間後に、DAPGreen及びRFPの蛍光像を共焦点顕微鏡にて確認しました。結果、DAPGreenと、LC3が共局在する結果が得られた。

Lamp1との共染色

Lamp1-tagRFP発現MEF細胞へ、DAPGreenとの共染色を行いました。結果、リソソーム膜選択的なLamp1とDAPGreenが共局在する輝点(オートリソソーム)とDAPGreenのみが輝点となる箇所(オートファゴソーム)が確認できました。(スケールバー:10 μm)

詳細は論文にて解説。
データ引用元: H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.

フローサイトでの定量解析

オートファジー誘導後に、DAPGreenの蛍光をフローサイトメーターにて検出しました。

イメージング条件
検出波長 :Ex. 488 nm / Em. 500-560 nm

DAPGreenで染色後のHeLa細胞を、アミノ酸不含培地にて0、3、6時間培養し、フローサイトメーターにて検出した。結果、飢餓培養開始から3時間後には、強い蛍光シグナルが検出された。

プレートリーダーでの定量解析

オートファジー誘導後のDAPGreenの蛍光を、プレートリーダーにて検出した。

検出条件
波長 :Ex. 450 nm / Em. 535 nm

DAPGreenで染色後のHeLa細胞を、アミノ酸不含培地にて0、2、4、6時間培養し、プレートリーダーにて検出した。結果、飢餓培養を開始してから2時間後には、コントロールより約3.5倍強い蛍光を確認した。

DAPGreenの励起、蛍光スペクトル

参考文献

参考文献を表示する

1) H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
2) L. Hu, T. Zhang, D. Liu, G. Guan, J. Huang, P. Proksch, X. Chen and W. Lin, "Notoamide-type alkaloid induced apoptosis and autophagy via a P38/JNK signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells"RSC Adv., 2019, 9, 19855.
3) Q. Chu, S. Zhang, M. Chen, W. Han, R. Jia, W. Chen and X. Zheng, "Cherry Anthocyanins Regulate NAFLD by Promoting Autophagy Pathway"Oxid Med Cell Longev ., 2019,DOI:10.1155/2019/4825949.
4) K. Koike, E. V. Berdyshev, A. M. Mikosz, I. A. Bronova, A. S. Bronoff, J. P. Jung, E. L. Beatman, K. Ni, D. Cao, A. K. Scruggs, K. A. Serban and I. Petrache, "Role of Glucosylceramide in Lung Endothelial Cell Fate and Emphysema"Am. J. Respir. Crit. Care Med. ., 2019,DOI:10.1164/rccm.201812-2311OC.

よくある質問

Q

DAPGreen working solutionは、どのくらい安定ですか?

A

DAPGreen working solutionの保存はできません。用時調製してください。

Q

DAPGreenのDMSO stock solutionは、どのくらい安定ですか?

A

DAPGreenのDMSO stock solutionは、調製後、-20℃、遮光下で保存してください。調製後1ヶ月間安定です。
また、使用量に応じて小分けし保存することをお勧めします。

Q

推奨の励起・蛍光フィルターを教えてください。

A

励起フィルター:425~475 nm
蛍光フィルター:500~560 nm

なお、共焦点顕微鏡を用いて488 nm励起により蛍光観察した実績がございます。
弊社HP内の製品ページの実験例を参照ください。

取扱条件

規格
性状: 本品はメタノール及びジメチルスルホキシドに溶ける。
純度(HPLC): 90.0% 以上
取扱条件
1.保存方法:冷凍,遮光, 2.窒素置換

製品分類一覧

分類一覧から探す

お探しの検索ワードを入力してください