01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

DAPRed - Autophagy Detection

DAPRed - Autophagy Detection

オートファジー(オートファゴソーム)の検出試薬

  • 製品コード
    D677  DAPRed - Autophagy Detection
容 量 本体価格
5 nmol ¥36,000

 DAPRedの最適濃度の検討については、
よくある質問の「DAPRedの最適濃度の検討方法を教えてください
をご覧ください。

製品の概要

オートファジーは、細胞内の不要なタンパク質・細胞内小器官等の再利用や代謝のための分解機構として様々な疾患への関与が示唆されています。DAPRedは培養細胞に添加するだけで簡便にオートファジーを検出できる蛍光試薬です。
DAPRedはオートファゴソーム膜に取り込まれ蛍光を発します。一方、DALGreenは凝集タンパク質等が分解されるオートリソソーム段階で蛍光を発します。この様にDAPRedとDALGreenは、オートファゴソーム形成およびリソソームとの融合・内容物の分解”の過程を試薬の添加だけでモニタリングすることができます。

マニュアル

はじめての抗体標識プロトコル

死細胞数を測りたい(吸光測定)

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST を用いた細胞毒性試験の例を紹介

お役立ち情報

技術情報

原理

オートファゴソーム膜が形成される際に、DAPRedは膜内に取り込まれ、脂溶性環境下に応答し蛍光が増大します。なお、オートファジーマーカーのLC3 を指標とした検出法とも高い相関性が得られています。

操作は試薬の添加だけ

遺伝子導入が不要。準備した細胞に試薬を添加するだけの簡単操作で蛍光イメージングを実現できます。

検出試薬の概要

ご使用の装置で検出可能な蛍光特性を確認の上、ご使用ください。

  対応装置 蛍光特性 容量 / 使用回数
の目安
既存検出法
蛍光顕微鏡 フローサイト
メーター
プレート
リーダー
関連製品DAPGreen
(オートファゴソーム検出)
Ex. 425-475
Em. 500-560
※ 共焦点顕微鏡では
488 nmにて励起可能
5 nmol x 1 /
35 mm dish: 25枚分
(0.1 μmol/Lで使用時)
LC3-GFP
MDC
Cyto-ID など
DAPRed × × Ex. 500-560 nm
Em. 690-750 nm
5 nmol x 1 /
35 mm dish: 25枚分
(0.1 μmol/Lで使用時)
DALGreen
(オートリソソーム検出)
× Ex. 350-450
Em. 500-560
※ 共焦点顕微鏡では
488 nmにて励起可能
20 nmol x 1 /
35 mm dish: 10枚分
(1.0 μmol/Lで使用時)
LC3-GFP-RFP
など

DAPRedとDALGreenの共染色

オートファゴソーム染色試薬DAPRedとオートリソソーム染色試薬DALGreenにより、HeLa細胞を染色後、飢餓培養によるオートファジーの誘導を確認しました。

 結果
アミノ酸不含培地で培養したHeLa細胞において、DAPRedとDALGreenの蛍光の増大が確認されました。

 検出条件

DAPRed :Ex. 561 nm / Em. 600-700 nm
DALGreen :Ex. 488 nm / Em. 500-563 nm
スケールバー :20 μm


 オートファジー誘導条件
DAPRedおよびDALGreenで染色後のHeLa細胞を増殖培地またはアミノ酸不含培地にて5時間培養し、共焦点顕微鏡にて観察しました。

スペクトルデータ

よくある質問

Q

DMSO stock solutionは、どのくらい安定ですか?

A

調製後は、-20℃、遮光下で保存してください。調製後1ヶ月間安定です。
また、使用量に応じて小分けし保存することをお勧めします。

Q

Working solutionは、どのくらい安定ですか?

A

Working solutionの保存はできません。用時調製してください。

Q

推奨の励起・蛍光フィルターを教えてください。

A

推奨フィルターは下記の通りです。
 励起フィルター:500~560 nm
 蛍光フィルター:690~750 nm
 

Q

DAPRedの最適濃度の検討方法を教えてください。

A

試薬の特性により、試薬の濃度が高すぎたり低すぎたりすると、オートファジー誘導時と誘導していないコントロールとの差が判りにくい場合があります。
下記の情報を参考に試薬濃度の検討することをお勧めします。

細胞種毎でDAPRedの最適濃度が異なります。
DAPRedを薄い濃度から(目安0.05 μmol/L)から数点段階的に振ってご検討ください(濃い濃度は0.4 μmol/Lを目安としてください)。

(参考)
小社では、HeLa, HepG2、CHO細胞にて、DAPRedの最適濃度の検討を行いました。
DAPRedを下記濃度で染色し、アミノ酸不含培地にて培養し、オートファジーを誘導しました。
その結果、下記の赤字の濃度条件ではコントロールとの差が見られました。

細胞種 検討濃度
HeLa 0.4 µmol/l 0.2 µmol/l 0.1 µmol/l 0.05 µmol/l
HepG2 0.4 µmol/l 0.2 µmol/l 0.1 µmol/l 0.05 µmol/l
CHO 0.4 µmol/l 0.2 µmol/l 0.1 µmol/l 0.05 µmol/l

Q

オートファジーにはどのような経路があり、 DAPRedはどの状態を検出するのですか?

A

オートファジーには、Atg5依存的オートファジー(LC3が変化する)とLC3の変化を伴わない、Atg5非依存的オートファジーがあることが知られております*。

DAPRedはオートファゴソーム膜に取り込まれ疎水環境下で蛍光を発し、オートファゴソームの状態を検出します。

*参考資料 : 新たなオートファジー機構の発見 清水重臣

▶初めて検出する細胞種や実験系の場合は、よくある問い合わせ【 DAPRedの最適濃度の検討手順】をご参照ください。

取扱条件

規格
性状: 本品は赤褐色固体でメタノール及びジメチルスルホキシドに溶ける。
純度(HPLC): 93.0% 以上
取扱条件
1.保存方法:冷蔵,遮光

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