02 酸化ストレス関連試薬

DPPH Antioxidant Assay Kit

DPPH Antioxidant Assay Kit

抗酸化能測定キット

  • キット化したDPPH法で抗酸化能を再現よく検出
  • 試薬の調製手間を大幅削減
  • 再現性の高いデータを実現
  • 従来の課題を解決
  • 製品コード
    D678  DPPH Antioxidant Assay Kit
容 量 本体価格
100 tests ¥6,400
500 tests ¥19,000
キット内容
100 tests ・DPPH Reagent
・Trolox Standard
・Assay Buffer
×1
×1
11 mL×1
500 tests ・DPPH Reagent
・Trolox Standard
・Assay Buffer
×1
×1
55 mL×1

性質

近年、体内の抗酸化力低下が様々な疾患の発症や健康障害に関与していることが示唆されており、抗酸化活性を有する食品(抗酸化食品)への期待が増えています。高知大学の島村らは、測定施設間差の少ない抗酸化活性評価法としてDPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)を用いた測定法を報告しています1)。本製品は島村らの測定法に準拠したマイクロプレート法による評価法です。DPPH による測定法をマニュアル化し、また安定した一定品質の試薬をキット化することで、これまで課題となっていたデータのバラつきや試薬調製の煩雑さを抑えることができました。
本製品は、高知大学 農林海洋科学部 農芸化学科 島村智子先生のご指導の下、製品化しました。
1) T. Shimamura et al., Anal. Sci., 2014, 30, 717 - 721

マニュアル

はじめての抗体標識プロトコル

死細胞数を測りたい(吸光測定)

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST を用いた細胞毒性試験の例を紹介

お役立ち情報

技術情報

簡単な準備

DPPH およびTrolox は溶液状態で不安定なため用時調製が必要ですが、特に測定に影響を与えるDPPH は、吸光度による含量確認まで行う必要があり、試薬調製には長い時間を要していました。本キットでは測定に必要な試薬が小分けされており、測定前の簡単な準備で、直ぐに実験を開始できます。
(DPPH の溶解操作には超音波洗浄機が必要です)

測定原理

測定方法

96 穴マイクロプレートに試薬とサンプルを添加し、30 分間反応するだけの簡単な操作です。

従来の課題を解決

DPPH による抗酸化活性の測定では、溶液中のpH や溶媒濃度が測定に影響します。本製品では、これらの影響を最小限に抑えるためのプロトコルと解析法を採用しています。

測定時のpHによる影響

製品添付のAssay Buffer により、一定のpH で測定が行えます。

サンプル溶媒の影響

サンプル量を反応液全体の1/10(20 μL)に規定し、サンプルを水やエタノールに溶解しても測定値に差が出ないよう最適化しています。

IC50値のばらつき

サンプルの抗酸化能をIC50 値のみで解析すると、僅かな測定条件の差でデータがばらつきます。
標準物質(Trolox)をサンプルと同時に測定し、抗酸化能をTrolox等価活性値(TEAC)として算出することで、再現性の高い測定値が得られます。
TEAC( μg TE/μg)= Trolox IC50 (μg/mL)/ Sample IC50( μg/mL)

 

測定例

施設間差の確認
3 施設において、本DPPH 法による抗酸化物質の測定を行いました。実験では、既知の抗酸化物質である没食子酸、カテキン、モリンをサンプルとしてキュベットを用いた分光光度計による測定を行い、Trolox 等価活性値(TEAC)として算出しました。結果、施設間で測定値の差は殆どみられませんでした。

参照元:T. Shimamura et al., NipponShokuhin Kagaku Kogaku Kaishi2007, 54, 482 - 487
 

マイクロプレートとキュベットによるデータの相関
上記の実験と同様に、3 種類の抗酸化物質をマイクロプレートを用いて測定し、Trolox 等価活性値として算出しました。結果、測定値はほぼ同等の結果が得られました。本キットではマイクロプレートを用いた測定となります。

よくある質問

Q

IC50値がばらつくのですが、注意点はありますか?

A

 (1) DPPH Reagentのチューブに溶け残りがないかご確認ください。

DPPHは溶けづらいため超音波洗浄機をお使い頂き、溶け残りなないよう、注意深く溶解して頂く必要があります。
特にチューブ底の先端にDPPHが溶け残ることがありますので、取扱説明書に記載の通り数回エタノールをチューブに移し入れ、エタノールに着色がなくなったことを確認しご使用ください。

 

(2) サンプルの希釈間隔が広い場合や、阻害曲線が飽和しているポイント(下図)で測定した場合IC50値が大きく変動することがあります。そのため、予備実験にて最適な濃度域を確認されることをお勧めします。

Q

ボルテックスやピペッティングでDPPHを溶解しても良いですか?

A

DPPHは溶解しにくいため、ボルテックスのみでの溶解やピペッティング操作での溶解はできません。
溶け残りがIC50のばらつきの原因となりますので、必ず超音波洗浄機をお使いください。

Q

測定可能なサンプル数について教えて下さい。

A

<100 tests使用時>
・本キットは96穴マイクロプレート1枚分を測定できる試薬となります。
・データ信頼性を確保するため、n=3での測定をお勧めしております。そのため、測定可能なサンプル数は、n:3で測定した
 ことを想定し下記の通り算出しております。
・1キットあたりのDPPH Reagent量は100 well分になります。
 (Blank2はDPPH Reagentを使用しないため、下記内訳のwell数にはカウントしていません)


未知サンプルの場合: 1サンプル
・小社キットで測定実績がない場合、1キットで1サンプル分の測定が可能です。

 <予備実験時の使用ウェル数:最適濃度域の確認>
  サンプル:8(8点の希釈系列) X 3(n:3) = 24 well
  Blank:1(Blank1) X 3(n:3) = 3 well

 <IC50値の算出時の使用ウェル数>
  サンプル:8(8点の希釈系列) X 3(n:3) = 24 well
  Trolox: 4(4点の希釈系列) X 3(n:3) = 12 well
  Blank:1(Blank1) X 3(n:3) = 3 well
  *予備実験不要のサンプルの場合、もう1サンプル測定が可能。


IC50値が既知の場合: 3サンプル
・小社キットでIC50値を既に測定した実績のあるサンプルの場合、3サンプルの測定が可能です。
 小社キットでIC50値を測定されていない場合は、未知サンプルとして予備実験をされることを推奨いたします。

<IC50値の算出時の使用ウェル数>
 サンプル:8(8点の希釈系列) X 3(n:3) X 3(サンプル数) = 72 well
 Trolox: 4(4点の希釈系列) X 3(n:3) = 12 well
 Blank:1(Blank1) X 3(n:3) = 3 welll



<500 tests使用時>
・本キットはDPPHが1プレート毎に測定できるように5本組みとなっております。
・下記内容は、500 testsをまとめて測定する場合の測定可能なサンプル数です。
 1プレート毎に測定する場合は、上記の100test使用時のサンプル数を参照ください。
・1キットあたりのDPPH Reagent量は500 well分になります。
 (Blank2はDPPH Reagentを使用しないため、下記内訳のwell数にはカウントしていません)

未知サンプルの場合: 8サンプル
・小社キットで測定実績がない場合、1キットで8サンプル分の測定が可能です。

 <予備実験時の使用ウェル数:最適濃度域の確認>
  サンプル:8(8点の希釈系列) X 3(n:3) X 8 (8サンプル)= 192 well
  Blank:1(Blank1) X 3(n:3) X 3 (3 プレート) = 9 well

 <IC50値の算出時の使用ウェル数>
  サンプル:8(8点の希釈系列) X 3(n:3) X 8 (8サンプル)= 192 welll
  Trolox: 4(4点の希釈系列) X 3(n:3) X 5 (5 プレート) = 60 well
  Blank:1(Blank1) X 3(n:3) X 3 (3 プレート) = 9 well
 

Q

反応から測定までの時間が長くなった場合、測定値に影響しますか?

A

反応時間が長くなると、測定値が変化する可能性があります。
再現精度のよい結果を得るためにも、取扱説明書に記載のインキュベーション(25℃、30分、暗所)後は速やかに測定ください。
複数のプレートを測定する場合、各プレート毎の測定までの時間を合わせてください。

Q

サンプルに濁りがある場合どうしたらよいですか?

A

取扱説明書に記載の前処理後ににごりがない場合には、そのまま測定が可能です。

前処理後に濁りがある場合には、弊社カスタマーサービスまでご連絡下さい。

フリーダイヤル 0120-489548

取扱条件

取扱条件
1.危険物第5類 ニトロ化合物 危険等級Ⅱ, 2.保存方法:冷蔵

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