DAPRed - Autophagy DetectionD677 取扱説明書

細胞内の不要なタンパク質や細胞小器官は、再利用または代謝するための分解過程が存在し、オートファジーと呼ばれています。この過程において、二重膜で構成される隔離膜は次第に伸長し、不要物を覆いオートファゴソームを形成します。内容物は、オートファゴソームとリソソームが融合したオートリソソームの段階で消化酵素により分解を受けます。この細胞機能はパーキンソン病などの神経変性疾患、老化に関りがあることが分かってきているため、ドラッグスクリーニングに対応した簡単なオートファジー検出手法が求められます。
低分子蛍光化合物のDAPRedは、構造特性により形成過程のオートファゴソームに導入され二重膜の疎水環境に応答して蛍光発光します。低分子のため細胞への導入も容易であり、遺伝子導入などの必要はありません。オートリソソームの蛍光ライブセルイメージングには、別途発売しておりますDALGreen[D675]が使用可能です¹⁾。

図1 DAPRedによるオートファジー検出

DAPRed - Autophagy Detection

5 nmol x 1

遮光、0-5℃にて保存してください。

• Dimethyl sulfoxide (DMSO)
• 培養培地
• HBSSまたはフェノールレッド不含培地
• Micropipettes

0.1 mmol/L DAPRed DMSO stock solutionの調製

DAPRed 5 nmolを含むチューブに50 μLのDMSOを加えピペッティングにより溶解する。

• 調製後は遮光、-20℃で保存してください。調製後1か月間安定です。

DAPRed working solutionの調製

最終濃度が0.1 μmol/LになるようにDAPRed DMSO stock solutionを培養培地で希釈する。

• 使用する細胞種によりDAPRed working solutionの最適濃度が異なります。最適条件をご検討ください。

 

1. 細胞をディッシュに播種し培養する。
2. 培地を除去後、培養培地で1回洗浄する。
3. 調製したDAPRed working solutionを添加し、37℃で30分間インキュベートする。
4. 上澄みを除去後、培養培地で2回洗浄する。
5. オートファジー誘導刺激剤を含む培地を加え37℃でインキュベートする。
   • オートファジー誘導条件に応じてインキュベート時間を設定して下さい。
6. 蛍光顕微鏡で観察する。

推奨フィルター	励起波長(nm)	蛍光波長(nm)
蛍光顕微鏡	500–560	690–750

共焦点レーザー顕微鏡による観察

CELLview 10 ウェルスライドにHeLa細胞を播種し37℃、5% CO₂インキュベーターにて一晩培養した。MEM培地(Thermo Fisher Scientific, 10% (v/v) fetal bovine serum、 2 mM L-glutamine、 1% nonessential amino acids、 100 units/mL penicillin、100 μg/mL streptomycin)で1回洗浄後、0.1 μmol/L DAPRed working solution 100 μLを添加し30分インキュベートした。MEM培地で2回洗浄後、MEM培地またはアミノ酸不含培地（和光純薬工業, 製品コード：048-33575）で6時間培養した。フェノールレッド不含培地に置換後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

図2 DAPRed染色HeLa細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像

検出波長： 561 nm (Ex) 600–700 nm (Em) スケールバー： 20 μm

DAPRedで染色したHeLa細胞を、A) 栄養豊富な培地（MEM培地）で6時間培養した後の画像、B) アミノ酸不含培地で6時間培養した後の画像。

DAPRedの励起、蛍光スペクトル

λex : 530 nm λem : 720 nm

1. H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu,and Y. Ueno, ‘’Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux’’, FEBS Lett., 2018, 592, 559-567.