01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

ATP Assay Kit-Luminescence

ATP測定キット

安定した発光による高感度検出
標準品の同梱で、不安定なATPの秤量が不要
試薬を加えるだけの簡単な操作

製品コード

A550　 ATP Assay Kit-Luminescence

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
50 tests	￥30,200	346-09793
200 tests	￥54,200	340-09791

キット内容

50 tests	・Enzyme Solution ・Substrate ・Assay Buffer ・ATP Standard	10 μl×1 ×1 5.5 ml×1 ×1
200 tests	・Enzyme Solution ・Substrate ・Assay Buffer ・ATP Standard	20 μl×2 ×2 11 ml×2 ×1

試験成績書

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性質

ATPは解糖系およびミトコンドリアの電子伝達系でつくられ、細胞が生きていくためのエネルギー源として重要です。細胞で合成されるATPのうち、約95%のATPがミトコンドリアで産出されるため、ミトコンドリア機能に異常が生じると、細胞のATP産出が低下し、その結果、がんや老化、アルツハイマー病などの神経変性疾患、ミトコンドリア病を引き起こすことが知られており、ミトコンドリア活性の指標の一つとしてATPが用いられます。また、がん細胞はミトコンドリアの酸化的リン酸化より非効率な解糖系を用いてATPを産出することが知られておりますが、最近の研究により解糖系の抑制によって解糖系から酸化的リン酸化にシフトすることもわかっており更に注目されています。

ATP Assay Kit-Luminescenceは、培養細胞中のアデノシン三リン酸(ATP)量をホタル・ルシフェラーゼ発光法で定量するキットです。本キットにはATP Standardが同梱されており、再現性の高いデータを得ることができます。また、試薬を混合し添加するだけで、培地の除去や洗浄といった複雑な操作は伴いません。マイクロプレートを用いた多検体測定が可能です。

マニュアル

技術情報

ATPの測定原理

ATP Assay Kit-Luminescenceは、培養細胞中のアデノシン三リン酸(ATP)量をホタル・ルシフェラーゼ発光法で定量するキットです。
本キットではマイクロプレートを用いた多検体測定が可能です。

安定した発光シグナルで高い再現性

本キットは試薬を混合し添加するだけで、培地の除去や洗浄といった複雑な操作は伴わず、半減期が3時間以上の安定した発光シグナルを得られます。
また、キットには ATP Standardが同梱されており、不安定なATPの秤量が不要で再現性の高いデータを得ることができます。

<測定条件>
試薬添加から3時間のタイムコースを測定
細胞種：HeLa細胞 (10,000cells/well)

検量線の作成例

本キットの ATP Standard を用いて作成した検量線からサンプル中の ATP 濃度を求めることができます。
サンプル中のATP濃度が 2.5 µmol/l 以上の場合は、サンプルを希釈することで測定いただけます。

実験例：ロテノンによる細胞内代謝の変化

ミトコンドリアの電子伝達系を阻害することが知られているロテノンをJurkat細胞へ添加後、本製品で細胞内の ATP濃度を測定したところ、ミトコンドリア呼吸鎖（電子伝達系）における ATP の生成が阻害され、コントロール細胞と比較してATP 量が減少しました。

実験例：による細胞内代謝の変化

シスチン / グルタミン酸トランスポーター (xCT) を阻害することが知られているを A549細胞へ添加後、細胞内のATP、α-ケトグルタル酸(α-KG)、グルタチオン (GSH)、ROSの変化と、グルタミン酸放出量の変化を確認しました。
その結果、SSZ 添加により細胞内のATP、グルタチオン(GSH)ならびにグルタミン酸放出量は減少し、細胞内のα-ケトグルタル酸とROSは増加しました。

<使用製品>
・細胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric (製品コード：K261)
・細胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit (製品コード：G257)
・細胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- (製品コード：R252)
・グルタミン酸放出量：Glutamate Assay Kit-WST (製品コード：G269)

<実験条件>
　細胞：A549細胞 (1 x 10⁶ cells) 　暴露時間：48時間

（スケールバー：50 µm）

参考文献) Shogo Okazaki et al., "Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma". Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

実験例：MASH誘導マウスの肝臓組織における代謝の変化

非アルコール性脂肪肝炎（MASH）の病変により組織中のATP、α-ケトグルタル酸（α-KG）、NAD量が減少することが知られています。4週齢から高脂肪食処理（MASH誘導）した1型糖尿病モデルマウス（STAMモデル）の肝臓組織を用い、組織内のATP、α-KG、NAD量を測定しました。
その結果、MASH誘導後10週齢のマウス組織ではATP、α-KG、NAD量が減少していることが確認されました。

※実験操作の詳細については「よくある質問：組織を用いた実験例はありますか？」をご参照ください。

<使用製品>

・組織内ATP ：ATP Assay Kit-Luminescence (製品コード：A550)
・組織内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric (製品コード：K261)
・組織内NAD ：NAD/NADH Assay Kit-WST (製品コード：N509)

<実験参考文献>

ATP	Francesco Bellanti, et al., "Synergistic interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and limits liver adaptation during nafld progression", Redox Biology, 2018, 15, 86-96.
α-KG	Jianjian Zhao, et al., "The mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic stellate cell activation", Bioscience Reports, 2020, 40, (3).
α-KG	Ali Canbay, et al., "L‑Ornithine L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty Liver Disease", Drugs, 2019, 79, 39-44.
NAD	Jinhan He, et al., "Activation of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase Sirt3", Mol. and Cell. Biol., 2013, 33, (10), 2047-55.

参考文献

参考文献を表示する

文献No.	対象サンプル	装置	引用（リンク）
1)	細胞 DLD-1 (ヒト結腸腺癌)	プレートリーダー	G. Enkhbat, A. Nakanishi, Y. Miki, "The BRCA2 missense mutation K2497R suppressed self-degradation and increased ATP production and cell proliferation", 2021, doi:10.1016/j.bbrc.2021.12.073.

よくある質問

Q 1キットで測定可能なサンプル数を教えて下さい: A

検量線の作成およびサンプルの測定をそれぞれn=3で行った場合、以下のサンプル数を測定できます。
96ウェルプレートのレイアウト例については、取扱説明書をご参照ください。
　・50 tests ：8サンプル
　・200 tests：48サンプル(96 ウェルプレート2枚で検量線を2回測定した場合)

Q 発光シグナルはどの程度安定ですか？: A

発光シグナルは3時間安定です。ただし、温度と光が発光に影響しますので、すぐに測定できない場合は、遮光し温度を一定(25℃付近)に保てる場所で静置してください。

Q 測定用のプレートは白色以外のプレートを使用できますか？

測定はできますが、ブラックプレートや透明プレートを用いた場合、発光強度が下がります。
また、透明プレートの場合はブランクが高くなりますので、白色プレートを推奨しております。

使用実績のある白色プレートは以下の通り

メーカー	製品名	ウェル底	Cat No.
住友ベークライト	発光測定プレート96F 白色	白色	MS-8096W
Thermo Scientific	96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	透明	165306
SPL Life Sciences	96ウェルクリアボトムプレートホワイト/PS	透明	SPL-33696 (33696)
Greiner	CELLSTAR, μClear, 96ウェル, マイクロプレート, TC (透明底, 低蒸発フタ付, ホワイト, 滅菌, PS)	透明	655098

Q 測定試料は保存できますか？: A

ATPが不安定なため保存できません。実験後は直ぐにWorking solutionを添加し、3時間以内に測定してください。

Q Working solutionは保存できますか？: A

冷凍(-20℃)で30日間の保存が可能です。
凍結融解を繰り返すことは試薬の劣化を招く恐れがありますので、その場合はあらかじめ小分けしてから保存することをお勧めします。

Q 組織を用いた実験例はありますか？: A

マウス肝臓組織を用いてATPおよびNAD/NADH量を測定した事例がございます。
実験操作の詳細は下記をご参照ください。

アルカリ抽出法による肝臓サンプルからの代謝指標の抽出

1. マウス肝臓100 mgあたり500 µlの冷えた0.5 mol/l KOH水溶液を入れる。
　*使用する組織は必ず灌流操作等で十分に脱血してください。血液の残存は測定に影響を与えます。

2. ダウンス型ホモジナイザーで組織を破砕する。
　*氷浴上で行ってください。

3. サンプルを回収し、サンプルチューブに移す。破砕に使用した容器を500 µlの冷えた0.5 mol/l KOH水溶液で共洗いし、チューブ内のサンプルと合わせる。
　（全量 1 ml）

4. 冷えた超純水 1 mlをサンプルチューブに加え、よく混合し氷上で5分間静置する。（全量 2 ml）
　*溶液の粘性が高いと、次操作の遠心後の分離が困難になる場合があります。その際は、シリンジに25 G(針のゲージ数)程度の細い針を付け、サンプル溶液をシリンジでスムーズに出し入れができるまで(20-30回)混合してください。

5. 12,000 x g , 4℃で5分間遠心し、上清を900 µlずつ二つのサンプルチューブに回収する。
　*１本をATP測定、もう１本をNAD/NADH測定に使用。ATPのみを測定する場合は900 μlx1本のみで構いません。

ATP測定用サンプルの調製
6. 上記5. で調製した900 µlのサンプルに200 µl の1 mol/l KH₂PO₄水溶液を入れ中和し、よく混合後氷上で5分間静置する。

7. 12,000 x g , 4℃で5分間遠心し、上清1 mlをサンプルチューブに回収し測定用サンプルとする。

<測定時の注意点>
*操作5、7で得たサンプルは保存できません。その日のうちに測定してください。
*スタンダード、サンプルの希釈には希釈用溶液として0.5 mol/l KOH水溶液と1 mol/l KH₂PO₄水溶液を9:5の比率で混合したものを使用してください。

＜測定例＞
NASH誘導マウス肝臓組織におけるATP量の変化

Q 発光測定の波長を教えてください。: A

本キットには、ホタルルシフェリンを使用しているため、発光測定の波長は556nmとなります。

取扱条件

取扱条件
保存条件: 冷凍 , 取扱条件: 吸湿注意

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