核小体染色試薬の比較

	極大励起波長	極大蛍光波長	MeOH固定化後の染色	PFA固定化後の染色	生細胞染色
Nucleolus Bright Green	513 nm	538 nm	〇	〇	△※
Nucleolus Bright Red	537 nm	605 nm	〇	〇	△※

※ 生細胞にて評価をご希望の際は、小社カスタマーサポートまでお問合せください。

鮮やかに核小体を見る

HeLa 細胞を4% PFA またはMeOH にて固定化後、PBS 洗浄および膜透過処理（Triton X-100）し、Nucleolus Bright Green またはRedおよび核染色試薬（DAPI）を添加、インキュベーション後に共焦点蛍光顕微鏡により観察しました。
結果、DAPI により染色された核内（青）に複数個の核小体が存在することが確認されました。

＜染色条件＞
・PFA 固定
　4% PFA に細胞を室温で5 分間、Triton X-100 に室温で20 分間浸漬後、各蛍光プローブにて5 分間インキュベーション。
・MeOH 固定
　冷MeOH に細胞を1 分間、Triton X-100 に室温で20 分間浸漬後、各蛍光プローブにて5 分間インキュベーション。

核小体への局在性

WI-38 細胞を 4% PFA にて固定化後、抗 Fibrillarin 1 次抗体および蛍光標識 2 次抗体により免疫染色し、Nucleolus Bright Green またはRed および核染色試薬（DAPI）を添加、インキュベーション後に落射型蛍光顕微鏡（キーエンス、BZ-X710）により観察しました。
結果、Nucleolus Bright Green 及び Nucleolus Bright Red は、核小体マーカー（dense fibrillar component）と染色部位が一致しました。

＜検出条件＞

核小体に関連した分野の報告例

関連分野	概要	論文
レビュー（老化）	様々な細胞機能に関与している核小体について、既に知られている癌や早老症との関わりを含め、特に老化に関する核小体機能について言及している。	V. Tiku, A. Antebi, “Nucleolar Function in Lifespan Regulation.”, Trends Cell Biol., 2018, 28(8), 662.
細胞老化	老化抑制に関与するタンパク質欠損により、核小体数の減少と核小体の総面積の増加がみられている。	H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep.,2017, 18(9), 2148.
細胞老化	rRNAプロセシング因子の枯渇により核小体が肥大化、併せてSA-βGalやp16発現が亢進した。	K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, N. Katagiri, M. Tsuchiya, N. Goto, R. Furumai, A. Murayama, J. Yanagisawa, K. Kimura, “Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation.”, Cell Rep., 2015, 10(8), 1310.
オートファジー	RNAポリメラーゼの転写阻害によりオートファジーの誘導と核小体の形状変化を確認している。	N. Katagiri, T. Kuroda, H. Kishimoto, Y. Hayashi, T. Kumazawa and K. Kimura, “The nucleolar protein nucleophosmin is essential for autophagy induced by inhibiting Pol I transcription”, Scientific Reports, 2015, 8903, DOI: 10.1038/srep08903.

老化細胞での評価

継代数の異なるWI-38 細胞を4% PFA にて固定化後、PBS 洗浄および1% Triton X-100 による膜透過処理し、Nucleolus Bright Green またはRed および核染色試薬のDAPI を添加しインキュベーション後に共焦点顕微鏡により蛍光を確認しました。
結果、継代数3 回の細胞では1 つの核に複数個の核小体が存在することが確認されましたが、継代を18 回行った細胞では核小体は肥大化し一つになっていることが確認されました。
老化に関連した論文は「参考論文」の項にご案内しています。

＜染色条件＞
4% PFA に細胞を5 分間、Triton X-100 に20 分間浸漬後、各蛍光プローブにて5 分間インキュベーション。

共焦点定量イメージサイトメーターによる定量解析

共焦点定量イメージサイトメーター（横河電機株式会社 CQ1）を用いた老化細胞の定量解析を行いました。
継代数の異なるWI-38細胞を固定化後、Nucleolus Bright Greenにより核小体を、DAPIにて核を染色し、共焦点定量イメージサイトメーターで定量解析を行いました。

画像解析による核小体の解析
共焦点定量イメージサイトメーターを用いて405 nmで核画像を、488 nmで核小体画像を撮影、解析ソフトウェアCellPathfinderで個々の核内の核小体を認識しその数を算出しました。

横河電機CQ1撮影条件 使用プレート ：96 well plate 対物レンズ ：40倍 撮影波長 ： 405 nm (DAPI)：青 488 nm (Nucleolus Bright Green)： 緑 視野 ：16視野 ＜解析画像＞ 青枠線：核 赤枠線：核小体

核小体数の解析
継代数の多い細胞において、1個の核に対して1個の核小体が存在する割合が増大し、2個以上の核小体が存在する割合は減少する結果が得られました。この結果は、下記論文中にある老化したWI-38細胞における核小体数の減少（論文中のTable 3）^*1、およびSETD8ノックダウンにより老化誘導した細胞の核小体の変化（論文中のFigure 4D）^*2と同様の結果になりました。

^*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.

^*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148. 

蛍光特性