Lipi-Deep Red
脂肪滴染色蛍光色素
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製品コードLD04 Lipi-Deep Red
| 容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
|---|---|---|
| 10 nmol ※ | ￥20,700 | 342-09631 |
※ 35 mm dish: 10 ～ 50 枚分
性質
Lipi シリーズは、脂肪親和性の高い低分子蛍光試薬であり、疎水性環境下で蛍光が増強します。また、試薬を添加するだけで生細胞および固定化細胞中の脂肪滴をイメージングすることができます。
マニュアル
技術情報
脂肪滴とその機能
脂肪滴は、トリアシルグリセロールやコレステロールエステルなどの中性脂肪が単分層のリン脂質一重膜によって取り囲まれた構造体です。脂肪滴は脂肪細胞のみに存在するわけではなく、すべての細胞に普遍的に存在しています。最近の研究から、脂肪滴はその表面に種々のタンパク質が結合し、体内の脂質代謝制御において重要な役割を担っていることが明らかになってきています1)。近年、脂肪滴とオートファジー2)、細胞老化3) といった細胞内現象との関連性も示唆されており、脂肪滴の形成・成長・融合・分解のメカニズムをより詳細に解明するツールが待ち望まれています。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂肪滴の染色例
オレイン酸を添加したHeLa細胞を生細胞の状態で、Lipi シリーズの各色素にて染色しました。
＜検出条件＞
・Lipi-Blue： Ex. 405 nm / Em. 450-500 nm
・Lipi-Green： Ex. 488 nm / Em. 500-550 nm
・Lipi-Red： Ex. 561 nm / Em. 565-650 nm
・Lipi-Deep Red：Ex. 640 nm / Em. 650–700 nm
＜染色条件＞
HeLa 細胞の培養液中に200 μmol/l オレイン酸を添加、一晩培養後に細胞をPBS で洗浄しLipi シリーズの各色素(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) にて15 分間染色し観察。
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オレイン酸溶液の調製方法について |
市販試薬との比較
Lipi シリーズでは、既存の脂肪滴染色試薬の課題（選択性、フィルター適応性、滞留性）を大幅に改善しました。また色素ラインナップの充実により、多重染色時の色素選択が容易に行えるようになりました。
| 同仁化学製品 | 市販品（T社） | ||||||
| Lipi-Blue | Lipi-Green | Lipi-Red | Lipi- Deep Red |
Oil Red O (比色) |
Nile Red | 試薬B | |
| 生細胞の染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | 〇 | 〇 |
| 固定化細胞の染色 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 | 〇 |
| 脂肪滴への選択性 （低バックグラウンド） |
〇 | 〇 | 〇 | 〇 | × | × | △ |
| 他色素との共染色*1 | 〇 | 〇 | 〇*2 | 〇 | n.d. | ×*3 | 〇 |
| 生細胞内での滞留性 (24h) | 〇 | 〇 | × | × | n.d. | × | × |
*1.共染色時の推奨フィルターについては、よくある質問「共染色時の推奨フィルターを教えてください。」をご覧ください。
*2.緑色蛍光と共染色する際は、550 nm以下の緑色蛍光フィルターを推奨
*3.GFP蛍光フィルター（500 ～ 540 nm）では漏れ込む
脂肪滴への高い選択性
オレイン酸を添加したHepG2 細胞を生細胞の状態で、100 nmol/l Lipi-Deep Red および100 nmol/l Nile Red (T社)にて染色しました。
結果、Nile Red では脂肪滴以外の細胞質も染色されました。
＜検出条件＞
Lipi-Deep Red： Ex. 640 nm / Em. 650 - 700 nm
Nile Red： Ex. 561 nm / Em. 565 - 650 nm
生細胞内での滞留性
HepG2 細胞を生細胞の状態で、Lipi シリーズの各色素、 T社Nile Red および試薬B にて染色。その後、培養培地にて30 分および24 時間培養後の蛍光像を確認しました。
Lipi-Blue およびLipi-Green は、染色後24 時間培養しても蛍光強度の低下はみられるものの脂肪滴内に色素が滞留していることが確認されました。一方、Lipi-Red、Lipi-Deep Red、Nile Red および試薬B は、細胞内の滞留性は低く長時間のライブイメージングには不適であることが確認されました。
実験例：脂肪細胞の脂肪滴イメージング
脂肪前駆細胞である3T3-L1細胞由来の脂肪細胞をLipiシリーズで染色したところ、脂肪細胞中の脂肪滴が明瞭に検出されました。
<脂肪細胞の染色実験例>
(1) ibidi µ-Plate 96 Wellの各ウェルに3T3-L1細胞（1.5 x 104 cells/well）を播種し、37℃、5% CO2インキュベーター内で培養した。
(2) 常法に従って脂肪細胞に分化誘導した。
(3) 上清を除去し、DMEM（25 mmol/l glucose, 10% FBS, phenol red free）で2回洗浄した。
(4) DMEM（25 mmol/l glucose, 10% FBS, phenol red free）で調製した各色素のWorking solutionを添加し、37℃で24時間インキュベートした。
(5) 蛍光顕微鏡で観察した。
※色素濃度：各2.5 µmol/l
実験例：脂肪組織の脂肪滴イメージング
マウス肝臓脂肪組織（凍結切片）を4% PFAで固定後にLipiシリーズで染色し、若いマウス（6週齢）と老化マウス（31週齢）の脂肪滴イメージング像を比較したところ、肝臓脂肪組織中の脂肪滴量に大きな差がみられました。
<組織サンプルの染色実験例>
(1) マウス肝臓脂肪組織（凍結切片）に4%PFA（PBS）を添加し、室温で5分間静置した。
(2) PBSで洗浄した後、各濃度のLipiシリーズ色素 working solution（PBS）を添加し、4℃で24時間静置した。
(3) PBSで洗浄した後、落射型蛍光顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。
※色素濃度：2.5 µmol/l（Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red）、25 µmol/l（Lipi-Red）
Lipiシリーズの蛍光特性
検出方法別 脂肪滴製品ラインナップ
| 品 名 | 容量 | 製品コード | |
|---|---|---|---|
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イメージング |
Lipi-Blue | 10 nmol | LD01 |
| Lipi-Green | 10 nmol | LD02 | |
| Lipi-Red | 100 nmol | LD03 | |
| Lipi-Deep Red | 10 nmol | LD04 | |
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数値化（プレートリーダー、FCM） |
Lipid Droplet Assay Kit - Blue | 1 set | LD05 |
| Lipid Droplet Assay Kit - Deep Red | 1 set | LD06 |
よくある質問
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Q
共染色時の推奨フィルターを教えてください。
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A
ご使用の色素と励起波長に応じて、下記表を参照のうえ共染色に適したフィルターを選択ください。
励起波長
（共染色色素）405 nm
（Hoechst, DAPI etc.）488 nm
（FITC, GFP etc.）561 nm
（Cy3, Rhodamine, RFP etc.）633 nm
（Cy5, mCherry etc.）Lipi-Blue Lipi-Blueの蛍光観察 Lipi-Blueは488 nm, 561 nmおよび633 nmでは励起されません。
そのため何れの蛍光フィルターでもご使用いただけます。Lipi-Green Lipi-Greenは405 nmで若干励起されます。
Lipi-Greenの蛍光漏れ込みを抑えるため、400-500 nmの範囲内の蛍光フィルターをお勧めします。Lipi-Greenの蛍光観察 Lipi-Greenは561 nmおよび633 nmでは励起されません。
そのため、何れの蛍光フィルターでもご使用いただけます。Lipi-Red Lipi-Redは405 nmで若干励起されます。
Lipi-Redの蛍光漏れ込みを抑えるため、400-500 nmの範囲内の蛍光フィルターをお勧めします。Lipi-Redは488 nmで若干励起されます。
Lipi-Redの蛍光漏れ込みを抑えるため、500-550 nmの範囲内の蛍光フィルターをお勧めします。Lipi-Redの蛍光観察 Lipi-Redは633 nmで若干励起されます。
Lipi-Redの蛍光漏れ込みを抑えるため、650-700 nmの範囲内の蛍光フィルターをお勧めします。Lipi-Deep Red Lipi-Deep Redは、405および488 nmでは励起されません。
そのため何れの蛍光フィルターでもご使用いただけます。Lipi-Deep Redは561 nmで若干励起されます。
Lipi-Deep Red由来の蛍光漏れ込みを抑えるため、560-610 nmの範囲内の蛍光フィルターをお勧めします。Lipi-Deep Redの蛍光観察
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Q
固定化細胞への染色は可能ですか？
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A
固定化した細胞でも染色は可能です。固定化細胞の染色手順は、下記を参照ください。
※ 固定化処理にはパラホルムアルデヒド(PFA)をご使用ください。メタノール等のアルコール固定は、脂肪滴の構造に影響を及ぼす可能性があるため、お勧めしません。 ※ 細胞によっては、染色前後の固定化操作により、染色されない又は感度が弱くなる場合があります。その際は、固定化条件を検討頂く必要があります。 染色後に細胞を固定化した例 ＜実績細胞 : HepG2細胞＞
①培地を除去し、PBSで二回洗浄した。
②プロトコル記載のWorking solution(in PBS)を細胞に入れ、37℃で30分インキュベートした。
③上清を除去し、PBSで二回洗浄した。
④4% PFA (in PBS)で5分間室温でインキュベートした。
⑤上清を除去し、PBSで洗浄後、観察。染色前に細胞を固定化した例 ＜実績細胞 : HeLa細胞＞
①培地を除去し、PBSで二回洗浄した。
②4% PFA (in PBS)で5分間室温でインキュベートした。
③上清を除去し、PBSで二回洗浄した。
④プロトコル記載のWorking solution(in PBS)を細胞に入れ、37℃で30分インキュベートした。
⑤上清を除去し、PBSで洗浄後、観察。
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Q
蛍光が確認できない場合の対処法は？
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A
蛍光が検出されない場合、幾つか要因が考えられます。
下記に示した項目を確認し、状況によっては最適化条件をご検討ください。①
励起・蛍光波長が色素の蛍光特性と合致していない。
製品HPに掲載の色素の蛍光スペクトルとお使いのフィルターを確認し、励起・蛍光波長が合致しているかご確認ください。② 染色条件が最適ではない。 [試薬濃度] - working solutionの濃度を下記の範囲で検討する。
Lipi-Blue, Lipi-Green：0.1-0.5 μmol/l
Lipi-Red：1-5 μmol/l
Lipi-Deep Red：0.1 μmol/l※
上記条件でも蛍光が検出されない場合、更に高濃度で染色する。
Lipi-Blue, Lipi-Green：1-2 μmol/l
Lipi-Red：10-20 μmol/l
Lipi-Deep Red：0.5 μmol/l[インキュベーション時間] - 通常は30分ですが、試薬添加後に1-2時間インキュベートする。 ③
固定化の条件が適していない。
細胞によっては染色前後の固定化操作により、染色されない又は感度が弱くなる場合があります。
その際は、「Q:固定化細胞への染色は可能ですか？」をご参照ください。④
脂肪滴が小さくて確認が困難。
細胞によっては脂肪滴が小さく、確認が困難な場合があります。
その際は、高倍率の顕微鏡での確認、又はオレイン酸処理した細胞によるポジティブコントロールを評価されることをお勧めします。
取扱条件
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