06 細菌研究用試薬

Microbial Viability Assay Kit-WST

Microbial Viability Assay Kit-WST

微生物増殖アッセイキット

  • 製品コード
    M439  Microbial Viability Assay Kit-WST
容 量 本体価格
100 tests ¥6,000
500 tests ¥21,300
キット内容
100 tests ・WST Solution
・Electron Mediator Reagent (DMSO Solution)
1 mL×1
0.1 mL×1
500 tests ・WST Solution
・Electron Mediator Reagent (DMSO Solution)
1 mL×5
0.5 mL×1

性質

水溶性テトラゾリウムであるWST-8(特許2757348)を発色試薬として用いた微生物の比色検出キットである。
微生物はエネルギー代謝活動により細胞内にNAD(P)Hを生成する。WST-8は電子メディエーターを介する事で、このNAD(P)Hにより還元され、水溶性formazan(オレンジ色)を生成する。このformazanの生成量は、微生物のエネルギー代謝活性に比例するため、オレンジ色への呈色を見ることで、その微生物の生存率や活性度合を確認できる。

 

特 長
1) 寒天培地法や微量液体希釈法に比べ短時間での検出が可能である。
2) マイクロプレートを使った多検体処理が可能である。
3) 培地成分による影響を受けにくい製品である。

本品は福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発製品である。

使用方法は、プロトコルをご覧ください。

マニュアル

技術情報

キット以外に必要なもの

・マイクロピペット(10 μL, 200 μL)およびマルチチャンネルピペット(200 μL)
・インキュベーター ・プレートリーダー(450~490 nmの吸光フィルター)
・96穴マイクロプレート ・1.5 mLチューブ

発色原理

各種微生物における検出感度

1) 培養した各微生物を標準液体培地(pH 7.0)で希釈した。
2) 1 ウェル(96ウェル-plate)あたり190 μLの微生物希釈液を添加した。
3) 各ウェルに発色試薬10 μLを添加し、30℃または37℃でインキュベートした。
4) 1 時間後及び4時間後の吸光度(460 nm :λmax WST-8 formazan)を測定した。

※微生物希釈液は標準寒天培地でも培養を行い、得られたコロニー数より細胞密度を決定した。

※表に示された細胞密度(CFU/mL)は、発色試薬添加後1時間または4時間インキュベートし、得られた吸光度(460 nm)が0.5以上であった各微生物毎の細胞密度(CFU/mL)である。

操作図


微生物懸濁液に試薬を添加

インキュベーター内で発色反応

吸光度検出

増殖アッセイ

生存への影響を比較

薬剤感受性試験

抗生物質(Oxacillin)濃度(μg/mL)

SA : Staphylococcus aureus
MRSA : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

黄色ブドウ球菌(SA) およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA) を96 ウェルプレートに播種後、各濃度に調整した抗生物質を添加した。6 時間37℃でインキュベート後、試薬を添加し更に2時間発色反応を行った。結果、生存細胞が存在するウェルのみ発色がみられ、目視にて容易に抗生物質の抗菌効果を確認できた。

薬剤感受性試験への応用

細菌を抗生物質を含むMueller-Hinton培地中で6時間(35℃)インキュベートした後、発色試薬を添加し2時間(35℃)反応させた。
各薬剤濃度において、発色が確認されなかった濃度を同キットにおけるMinimum inhibitory Concentration(MIC)とした。 
Microdilution method(日本化学療法学会標準法)では22時間のインキュベーション後に目視でMICを求めるが、本キットを用いた場合、8時間でMicrodilution methodと同等のMIC(μg/mL)を得ることができた。

微生物増殖試験

E.coli懸濁培地を10倍希釈系列で96 ウェルマイクロプレートに播種した。
発色試薬を添加し、37℃でインキュベートしながら一定時間ごとの吸光度(460 nm)を測定した。
各菌体密度においてOD 460が0.5に達した時間を求めると、菌体密度とOD 460 =0.5到達時間との間に高い直線関係が得られた。

よくある質問

Q

1cmや0.25cmのセルを使って測定はできますか?

A

基本的には測定は可能です。
但し、96ウエルマイクロプレートと比較して、発色試薬量を多く必要としますので、実際に測定可能な検体数が減少します。

Q

糸状菌での使用実績はありますか?

A

Aspergillus属の麹菌を使用した実績があります。

Q

菌の増殖試験を行う場合、インキュベート時間はどれくらい行えばよいでしょうか?

A

微生物種(菌)の細胞密度により、インキュベート時間が異なります。
例えば、細胞密度が1x106 CFU/mLで、約6時間後にコンフルエントに達する場合、2~5.5時間の間でインキュベートすることで、菌数を確認することができます。

Q

偏性嫌気性菌の測定は可能ですか?

A

 偏性嫌気性菌は、酸素に暴露することで死滅し、十分な発色が得られないため測定できません。

取扱条件

取扱条件
1.危険物第4類 第3石油類 危険等級Ⅲ, 2.火気厳禁 3.保存方法:冷蔵
危険・有害
シンボルマーク
感嘆符

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