何故、正確なリソソーム機能を解析できるのか

pHLys Greenと既存製品の比較

既存のリソソームpH検出試薬は色素の局在性、pH感受性、滞留性に課題があり、 pHLys Greenはこれらの課題を解決した色素です。改善された色素滞留性と局在性により正常なリソソームを検出することができ、さらにpH感受性が向上したことで僅かなpH変化を検出することが可能です。

※LysoPrime Deep Redと既存製品の比較はこちら

キットの特長と既存試薬との比較

測定に必要な試薬を1つのキットに同梱しております。また、色素の蛍光特性から、赤色の蛍光特性を持つ色素との共染色が可能です。

同仁化学のリソソーム検出色素シリーズは、既存の染色色素に比べ選択的にリソソームへ集積し24 時間以上染め続けます。これらの色素を
組み合わせて使用することで、リソソームの量とpH をより正確に確認することができます。

実験例 ：Bafilomycin A1 を用いたリソソームpH 変化のイメージング・FCM 解析

HeLa 細胞を用いて、リソソーム酸性化阻害剤Bafilomycin A1（Baf. A1）で処理した際のリソソームの量とpH 変化を検出しました。LysoPrime Deep Red の蛍光は、 Baf. A1 添加にかかわらず殆ど変化しませんが、pHLys Green はBaf. A1 添加に伴うリソソーム中性化により蛍光の低下が確認されました。またフローサイトメーターでも検出が可能でした。このことから、Baf. A1 添加によりリソソーム機能は低下するもののリソソームの量には影響がないことが判りました。

＜検出条件＞ pHLys Green（緑）： Ex=488 nm, Em=490-550 nm LysoPrime Deep Red（紫）： Ex=633 nm, Em=640-700 nm

＜検出条件＞ pHLys Green （FITC Filter）：Ex=488 nm, Em=515-545 nm LysoPrime Deep Red （APC Filter）：Ex=640 nm, Em=650-670 nm

[FCM用プロトコル]

HeLa細胞 5x10⁴ cells/mlを準備し、6wellプレートに2ml (1x10⁵ cells/well) 添加し一晩培養
↓
洗浄2回(HBSS)
↓
LysoPrime DeepRed(HBSS)working solution 2ml添加 ※Stock solu.を800倍希釈
37℃30分
↓
洗浄2回(HBSS)
↓
pHLys Green（HBSS）working solution 2ml添加　※Stock solu.を1000倍希釈　
37℃30分
↓
洗浄2回(HBSS)
↓
Trypsin
↓
FCM

実験例：細胞内鉄の変化とリソソームpH変化の測定

神経変性疾患では、リソソーム機能と鉄との関係が注目されており、リソソームが中性化することで貯蔵鉄 (Transferrin or Ferritin)が分解されず、細胞内の鉄が減少することが報告されています*。
リソソーム酸性化阻害剤(Bafilomycin A1(Baf. A1))もしくは鉄キレート剤 (Deferipron (DFP))を添加したSH-SY5Y細胞を用いて、同一サンプル内のリソソームpH変化と細胞内鉄の変化を検出しました。(リソソームpH:本キット、細胞内鉄:FerroOrange[Code:F374])
その結果、Baf. A1の添加によりFerroOrangeの蛍光が低下したことから細胞内鉄の減少が確認されました。また、LysoPrime Deep Redの蛍光は殆ど変わらず、リソソームの中性化によりpHLys Greenの蛍光が低下しました。
以上より、細胞内鉄の変化とリソソームの機能に関連性があることが示唆されました。

*Mol Cell., 2020, 77(3), 645-655.

SHSY-5Y 細胞を用いて、リソソーム酸性化阻害剤 Bafilomycin A1 (baf.A1) もしくは鉄キレート剤 Deferipron (DFP)で処理した細胞のリソソームの量とpH変化、そして細胞内鉄の変化を検出しました。

リソソーム染色試薬・キット一覧

同仁化学ではリソソーム染色試薬、pH検出試薬・キットをランナップしております。ご自身の実験系に合わせてお選びください。