-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit (for Flow cytometry)BS01 取扱説明書

-Bacstain- series は細菌用の蛍光染色試薬群です。下図に示す異なる 3 つの手法により菌の生存率を求める事が可能です。 CTC は菌の呼吸活性により還元を受け、蛍光性 formazan を生成します。生菌に選択的な蛍光色素として、多く用いられ ています。

-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit はエンハンサーの効果により、従来のCTC染色をより迅速・高感度にできるキットです。

CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)	10 mg x 3
Enhancing reagent A	100 μl (DMSO solution) x 1

0-5 ℃ にて保存して下さい。

• インキュベーター

• マイクロピペット (20 μl, 1,000 μl)

• Flow cytometer (488 nm laser, red emission filter)

1. CTC の入ったチューブ 1 本に対し、滅菌水 750 μl を加え良く混合し CTC を溶解する。 この時 CTC の濃度は 50 mmol/l となる。^a) 
2. 菌を PBS(-) もしくは生理食塩水に懸濁し、細胞密度を調整する。10⁶ cells/ml (flow cytometry) .^b)
3. 細胞懸濁液 1 ml に対し、下表に示された量の試薬を加え、ボルテックスミキサーで混合する。

   	CTC solution	Enhancing reagent A
   Flow cytometry	20 μl	1 μl

4. 37 ℃ にて 30 分間インキュベートする。^c)
5. フローサイトメーターで観察する。

a)	溶解後の CTC 溶液は -20℃で 2 週間保存可能です。
b)	染色時に培地成分が残っていると、CTC の非特異的な還元反応が起こりますので、染色前は PBS(-) や生理食塩水で洗浄後、 置換して下さい。
c)	CTC による染色効率が良くない場合は、CTC 溶液を追加するかインキュベーション時間を長くして下さい。 CTC 溶液を追加される場合は細胞懸濁液 1 ml に対し、最大添加量を 100 μl / サンプル までとして下さい。

 

Enhancer (+)

 

Enhancer (-)

CTC 染色した Candida albicans のフローサイトメトリー解析

CTC に対するカウンター染色試薬として -Bacstain- DAPI solution を用いる事ができます。DAPI は膜損傷の有無に関わら ず、細胞内透過し核酸を染色します。DAPI で存在する全ての菌を、その内呼吸活性を有する菌を CTC で染色できます。 DAPI 染色時にはホルマリン固定（1 〜 4％）を特に必要としませんが、固定を行う場合は CTC 染色後に行って下さい。 DAPI染色時はCTCで染色した細胞懸濁液 1 mlに対し、1 μlの -Bacstain- DAPI solution を加え、室温で5分間インキュベートした後、蛍光観察して下さい。

本マニュアルに準じた場合、約 100 検体分の測定が可能です。

1. A. Hiraishi and N.Yoshida, "An Improved Redox Dye-Staining Method Using 5-Cyano-2, 3-Ditoryl Tetrazolium Chloride for Detection of Metabolically Active Bacteria in Activated Sludge", Microbes Environ., 2004, 19(1), 61.
2. A. Kitaguchi, N. Yamaguchi and M. Nasu, "Enumeration of Respiring Pseudomonas spp. in Milk within 6 Hours by Fluorescence In Situ Hybridization Following Formazan Reduction", Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71(5), 2748.

-Bacstain- CFDA solution

CFDA はエステラーゼ活性により蛍光を発する色素として、菌染色で広く用いられています。 -Bacstain- CFDA solution は CFDA を DMSO 溶液としていますので、調製の手間無くご使用頂けます。 CFDA はそれ自体では蛍光を持ちませんが、細胞内に存在するエステラーゼにより蛍光性のカルボキシフルオレセインと なります。

 

-Bacstain- DAPI solution, AO solution

DAPI 及び AO は核酸染色試薬として頻用されます。膜損傷の有・無 に関わらず細胞内に透過し、核酸を染色します。

 

-Bacstain- PI solution

PI は損傷した膜をもつ細胞にのみ透過し、核酸を染色します。

 

Products	Code	Maximum Ex/Em(nm)	Number of assays
CTC Rapid Staining Kit (for Flow cytometry)	BS01	430, 480/630	100
CTC Rapid Staining Kit (for Microscopy)	BS02	430, 480/630	100
CFDA solution	BS03	493/515	100
DAPI solution	BS04	360/460	100
AO solution	BS05	420 〜 460/630 〜 650(ssDNA)	100
PI solution	BS07	530/620	100

これらは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発製品です。