1つの細胞種で同一細胞数にて実験する場合24サンプル測定可能です。

*２種類以上の細胞種や複数の細胞数を実験に用いる場合は、別途BlankとControlを準備する必要があり測定可能なサンプル数が変わります。詳細については、取扱説明書に実験系に応じたプレートレイアウトの例を記載しておりますのでご参照ください。
 

Jurkat細胞の実験例をご案内します。
＜操作＞
(1)Blank 3としてJurkat細胞(3.0×10⁶ cells/ml)をRPMI培地に懸濁し、ControlやSampleとしてJurkat細胞(3.0×10⁶ cells/ml)をworking solutionに懸濁したものを用意し、96穴黒色クリアボトムマイクロプレートに100 µl (300,000 cells/well)ずつ播種した。
(2)Blank 1にはRPMI培地を100 µl、Blank 2にはworking solutionを100 µl添加した。
(3)予め37℃に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、30分間インキュベーションした。
(4)Blank 1, Blank 2, Blank 3, ControlにRPMI培地を10 µlずつ添加した。
(5)Sampleには、RPMI培地で希釈したSample solution(AntimycinもしくはFCCP溶液)を10 µlずつ添加した。
(6)Sample solution添加後は、直ちにMineral Oilを1滴ずつ各ウェルに滴下した。
(7)37℃に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、5分間インキュベーションした。
(8)蛍光プレートリーダーを用いて強度をタイムコースで10分毎に200分間測定した(Ex: 500 nm, Em: 650 nm, Bottomリーディング)。
(9)ダウンロードした専用の計算シートに得られた強度の値を入力し、OCR値を算出した。 

各ウェルに必要なサンプル及び試薬の添加量

＜結果＞

専用の計算シートをダウンロードし、以下の手順でOCRを算出します。

＜OCR算出手順の概要＞

(1)OCR測定で得られた強度の値を計算シートに入力すると、Stern-Volmerの式より酸素量(nmol)が自動的に算出される。
(2)時間(min)と酸素量(nmol)のグラフより、測定した全ての条件において直線性の得られる範囲を確認する。
(3)2)で確認した時間(min)と酸素量(nmol)の範囲における傾きを算出する。
(4)3)で算出した傾きより、OCR(pmol/min)を算出する。
詳細は取扱説明書の"解析"をご参照ください。

試薬の添加およびMineral Oil添加後のマイクロプレートのインキュベーションを、インキュベーター(ヒートブロックや恒温槽など)で行うとプレートリーダー内との温度差が生じ正確なOCR変化が測定できません。再現性の低下に繋がります。そのため必ずプレートリーダー内で行って下さい。

＜操作概要＞

取扱説明書の浮遊細胞:操作3),7)、付着細胞:操作5),9)にあたります。

＜インキュベートの環境による結果への影響＞

Mineral oilを添加した細胞においてCell Counting Kit-8による細胞毒性測定を行ったところ、毒性は確認されませんでした。

(参考)

核染色剤(Hoechst 33342)を用い、ウェルあたりの細胞数を算出した実験例をお示しします。

＜操作＞
(1)OCR測定用ウェルに細胞を播種した。
(2)段階希釈した細胞を検量線作成用ウェルに播種した。
(3)取扱説明書に従いOCRを測定した。
(4)検量線作成用ウェルに培地を10 µl/wellずつ添加した(液量をOCR測定用ウェルと110 µl/wellに揃えるため)。
(5)培地で希釈したHoechst 33342溶液(10 µg/ml)を全てのウェルに100 µl/wellずつ添加した。
 ※OCR測定用ウェルはオイル上から添加した。
(6)37℃、30分間インキュベートした。
(7)蛍光プレートリーダーにて測定した(Ex: 350 nm , Em: 461 nm )。
(8)検量線(X軸：細胞数、Y軸：蛍光強度)を作成し、OCR測定用ウェルの細胞数を算出した。

working solutionは保存できません。用時調製してください。

 Oxygen ProbeおよびMineral Oilは凍結融解を繰り返した場合も測定に影響がないことを確認しています。

Topリーディングでの測定は、オイルの影響を受けるためお奨めしません。Bottomリーディングでの測定を推奨しております。

シェイキングする必要はありません。お客様の事例となりますが、シェイキングすることで値がバラつき易くなる傾向がみられております。

測定自体は可能です。ただし、血清含有よりも蛍光値としては低く出る傾向が得られています。結果を比較する場合は毎回同じ培地条件で測定してください。

本キットは37℃、110 μl液量中の酸素濃度から酸素消費速度を求める仕様に最適化しております。37℃以外の温度では測定自体は可能ですがキットとしてのOCRは算出出来ません。

以下の3点をご確認ください。

(1) 測定時の温度がバラつくと正確なOCR変化が測定できません。
　以下の操作をご確認ください。
　 ・Mineral Oilや培地、培地で希釈したSample solutionは使用前に37℃付近になるように予め加温してください。
　 ・試薬の添加後及びMineral oil 添加後のインキュベーションは、必ず37℃の蛍光プレートリーダー内で行ってください。
　　よくある質問「なぜプレートリーダー内でマクロプレートを恒温にするのですか」をご参照ください。

(2)細胞数が少ない可能性があります。
　細胞数を増やしてご検討ください。

  　 【細胞数と薬剤処理有無でのOCR変化（イメージ図)】
 　   

(3)細胞の影響
　1),2)を確認してもなおOCR値に差が得られない(小さい)場合、以下のような可能性がございます。

　   ・細胞自体の呼吸量が少ない。正常細胞はがん細胞と比較しOCRが低くなる傾向があります。
　　・細胞のエネルギー産生を解糖系へ大きく依存している。

　　（参考)
      ２種類のがん細胞(HeLa細胞とHepG2細胞)のOCRを比較した際、エネルギー産生を解糖系へ大きく依存しているHeLa細胞はHepG2細胞と比較しOCR値が低い結果が得られました。
     
　　　※細胞種における代謝経路依存性の確認方法については、こちらをご覧ください。

以下の５点をご確認ください。

(1) Bottom リーディングで測定していますか？
Top リーディングでの測定は、オイルの影響を受け正しい値が得られないことがあります。Bottomリーディングでの測定を推奨しています。

(2) 測定Well内の温度は一定ですか？念のため実測値をご確認ください。
 OCR測定は温度に非常に敏感です。Well内の温度がばらつくと初期の測定値がばらつきやすくなりOCR値に影響します。対処法は、よくある質問 なぜプレートリーダー内でマイクロプレートを恒温にするのですか をご参照ください。

(3) シェイキングを行っていませんか？
お客様の実績より、シェイキングすることで結果がばらつきやすくなる傾向が得られております。シェイキング無しでもお試しください。

(4) 測定毎の照射時間、照射回数の設定値を通常(デフォルトの設定値)よりも高い値に設定していませんか？
１回の照射時間や照射回数が高すぎると、強い励起光を経時的に当て続けることになり、プローブが劣化する可能性があります。設定値を下げてご検討ください。
※プレートリーダーの機種により設定項目が異なります。設定についてはプレートリーダーのメーカー様へお問い合わせください。

(5) 酸素消費量がキットでは検出できない非常に小さい量の可能性があります。
細胞数を増やしてご検討ください。また、よくある質問 コントロールと薬剤処理サンプルのOCR値に差がありません。どのような要因が考えられますか？ も併せてご参照ください。