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生細胞アクチンイメージング用プローブ「SiR-XActin」による細胞動態観察の新展開

株式会社同仁化学研究所　山本　啓登

　アクチンは真核細胞において最も豊富に存在するタンパク質の一つであり、球状アクチン（G-アクチン）、G-アクチンが結合したマイクロフィラメントアクチン（F-アクチン）、およびアクチン結合タンパク質（ABS）によって構成されている。中でもF-アクチンは、細胞の縁にあるラメラポディア（葉状仮足）、細胞の形を維持するストレスファイバー、細胞分裂時に現れる収縮環、さらには神経細胞の軸索など、細胞内の動的な高次元ネットワークを形成し1）、細胞の形態変化、運動能、細胞質分裂、オルガネラ輸送など、構造的・動的機能の両方の役割を担っている2）。そのため、細胞がどのように生き、動き、増えるのかという生物学的プロセスを理解するためにアクチンが関与するプロセスを可視化して評価することは非常に重要である。
　これまでのアクチン可視化プローブとしてはSiR-Actin（図1a）などが知られている。この骨格は、アクチンへ結合するjasplakinolide構造（図1b）を有しており、リンカーを介してSi-ローダミンを結合させることで細胞透過性を有する蛍光色素として設計されており、不死化細胞株、初代培養細胞、オルガノイド、組織などの生細胞におけるF-アクチンの可視化が可能であった。しかしながら、その後の検討においてアクチンとの強すぎる結合により、自然な重合・脱重合プロセスを反映していない可能性が示唆されている3）。また、細胞の遺伝子を改変することでF-アクチンをイメージングする方法4）なども報告されているが、多くのアプリケーション評価においては低分子の蛍光プローブが好まれ、可視化出来ない場合の最終手段として利用されるに留まっており、汎用面において課題を抱えていた。
　そこでNasufovicらはこれまでの課題を解決するため、従来のSiR-Actinをベースに、jasplakinolide構造とgeodiamolide Aの構造を組み合わせたハイブリッド骨格（図1c）や、リジンリンカーを介してSi-ローダミンと結合した構造（図1d）を有する、新規のアクチン可視化プローブ“SiR-XActin”を開発した5）。F-アクチンと結合するハイブリッド骨格は、元のjasplakinolideよりも細胞毒性が低く、リンカーに使用されているリジン残基についても、結合溝の外側を向くことで結合を著しく妨げることなく蛍光体の接触が可能になるように設計されている。HeLa細胞での評価においては、従来のSiR-Actinは細胞運動が著しく低下したのに対し、SiR-XActinでは細胞運動にはほとんど影響を与えていないことが確認された。結合親和性を評価したところ、SiR-XActinは従来のSiR-Actinよりも約100倍低い親和性が示され、細胞毒性や細胞運動能の結果と相関性が有ることが示された。また、SiR-XActinのシグナル強度は35時間以上安定しており、撮影中には複数のラメリポディア、フィロポディア、そして収縮リングが観察されるなど、高度に制御されているアクチンネットワークへの影響が非常に少ないことが示された。そして、長期間の観察により退色が起こった後も、SiR-XActinは初期強度の約30% ± 3%の安定した信号を示した。この結果について、SiR-XActinは結合親和性が低いためにプローブの交換が容易に起きやすく、退色が起こったとしても別のフレッシュなプローブと置き換わることで信号強度が安定しているものと推測される6）。
　U-2 OS細胞では、SiR-Actinはベラパミルを添加することでF-アクチンを効率的に標識されるが、SiR-XActinはベラパミルが存在しない場合でも効率的に標識されることが確認され、3T3およびCOS-7といった別細胞株においても同様の結果を示した。ベラパミルは、ローダミンなどの異物を細胞から積極的に排除するトランスポーターとして知られるヒトP糖タンパク質や多剤耐性タンパク質1（MRP1）を阻害する働きがあり、ベラパミル添加の不要なSiR-XActinは代謝やシグナル伝達への潜在的な影響がより少ないことが期待される。近年では、F-アクチンは毒性ストレスを受けることで過剰にジスルフィド結合が発現し、最終的に細胞死が起きることも報告7）されており、毒性評価における指標としても注目されている。
　更に、蛍光体であるSi-ローダミンを置き換えた図2に示す化合物群においても、固定細胞及び生細胞において非生理的なアクチン表現型を誘導することなく良好な標識性を示しており、XActinリガンドが蛍光体を調整することで多様な波長に対応できる可能性が示された8）。これにより、今後の細胞生物学における様々な動的プロセスの解明や毒性評価に大きく貢献することが期待される。

図1　アクチン可視化プローブ
図1　アクチン可視化プローブ

a) SiR-Actin, b) jasplakinolide構造, c) jasplakinolide構造とgeodiamolide A構造を組合わせたハイブリッド骨格, d) SiR-XActin

図2　SiR-XActinの蛍光体を組み替えた化合物
図2　SiR-XActinの蛍光体を組み替えた化合物

［参考文献］

  1. R. S. Kadzik et al., “F-Actin Cytoskeleton Network Self-Organization Through Competition and Cooperation”, Cell Dev. Biol., 2020, 36, 35-60.
  2. R. Dominguez et al., “Actin Structure and Function”, Annu. Rev. Biophys., 2011, 40, 169-186.
  3. L. R. Flores et al., “Author Correction: Lifeact-TagGFP2 alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour”, Sci. Rep., 2019, 9, 9507.
  4. J. Riedl et al., “Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin”, Nat. Methods, 2008, 5, 605-607.
  5. V. Nasufovic et al., “SiR-XActin: A Fluorescent Probe for Imaging Actin Dynamics in LiveCells”, Angew. Chem. Int. Ed., 2025, 64, 50.
  6. C. Spahn et al., “Whole-Cell, 3D, and Multicolor STED Imaging with Exchangeable Fluorophores”, Nano Lett., 2019, 19, 500-505.
  7. Y. Shuai et al., “Disulfidptosis: disulfide stress-induced novel cell deathpathway”, MedComm, 2024, 5(7), e579.
  8. G. Lukinavičius et al., “Fluorogenic Probes for Multicolor Imaging in Living Cells”, J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 9365-9368.
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