MitoPeDPP を用いたミトコンドリア内脂溶性過酸化物の検出
生命は酸素を利用することで、効率的にエネルギーを取り出すことが可能となり大きく進化してきた。しかし、酸素の一部はその代謝過程で活性酸素種（ROS）と呼ばれる分子に変わる。この ROS が過剰な状態は「酸化ストレス」と呼ばれ、生体内の様々な器官や細胞が酸化され疾病や老化の引き金となることが知られている。
過剰発生した ROS は、その強い酸化能により DNA やタンパク質、脂質等を酸化し、結果としてニトログアノシンやカルボニルタンパク質、過酸化脂質等の変異体および代謝物が生成される（図 1）。これら変異体および代謝物は生体内酸化ストレス状態のマーカーとして測定されており、疾病と酸化ストレスの関連を解明する研究が広く進められている。
小社にて開発した MitoPeDPP はミトコンドリアの脂溶性過酸化物を蛍光検出によりモニターできる試薬である。本稿ではこの MitoPeDPP を実験に供した 2 報を紹介する。
ROS は神経細胞の細胞死を誘発するが、その詳細なメカニズムは解明されていない。Fukui らは、神経芽細胞 N1E-115 を用いて細胞死誘発前の神経突起変性メカニズムの解明を進めている1）。
著者らは種々の濃度のイオノマイシンで処理した N1E-115 細胞の神経突起形態を観察し、低濃度イオノマイシン処理により細胞死に至る前に神経突起が変性することを確認した。次いで神経突起変性のメカニズムを解明するため、カルシウムイオン蛍光プローブ Fluo 4-AM を用いた蛍光イメージング解析を行い、低濃度（1 μmol/l）のイオノマイシン処理によりカルシウムイオンが細胞内へ即座に流入することを確認した。このカルシウム流入と細胞内酸化ストレスとの関連性を調査するため、ミトコンドリア ROS 蛍光プローブ MitoSOXTM およびミトコンドリア過酸化脂質蛍光プローブ MitoPeDPP を用い、生細胞での蛍光イメージング解析を行った。その結果、MitoPeDPP による解析では低濃度イオノマイシン処理により MitoPeDPP の蛍光増大が観察され（図 2）、さらには神経突起部位での MitoPeDPP 蛍光増大も観察された。イオノマイシン処理細胞におけるチオバルビツール酸反応性物質（TBARS）の値も高かったことから、低濃度イオノマイシン処理による神経突起変性メカニズムには、細胞内へのカルシウムイオン流入を引き金として細胞内 ROS が発生し、更にミトコンドリア過酸化脂質産生が関与していると結論している。
また、Nakabeppu らは、アルツハイマー病（AD）モデルマウスおよび iPS 細胞由来の AD モデルヒト神経細胞を用い、hTFAM（human mitochondrial transcriptional factor A）がアルツハイマー病の原因となるミトコンドリア DNA （mt DNA）の分解やアミロイドβ（A β）の蓄積を抑制することを明らかにしている2）。
著者らは hTFAM 発現 AD モデルマウスにおいて、シトクロム c オキシダーゼ活性測定や Morris water maze 試験によりミトコンドリア障害の抑制や認知機能の改善を確認し、更には蛍光免疫染色により A β や 8-oxoguanine の蓄積が抑制されていることを確認した。また AD モデルヒト神経細胞での MitoPeDPP による脂溶性過酸化物の検出では、リコンビナント hTFAM 処理した細胞において MitoPeDPP の蛍光が優位に減少しており、ミトコンドリア過酸化脂質の生成が抑制されていることが確認された。このように hTFAM がアルツハイマー病の原因因子に与える影響は、今後の新たな治療法開発に繋がる有用な知見である。
このように、発生した ROS により酸化傷害を受けたミトコンドリア内の脂溶性過酸化物のライブセル解析を行うことで、疾病や細胞内イベントのメカニズムを理解することにつながる。各種 ROS や酸化ストレスマーカーに選択的で、かつ細胞内オルガネラ選択的に局在化する蛍光プローブは今後の研究に有用なツールとなり得ると考えられる。
[参考文献]
1） S. Nakamura, A. Nakanishi, M. Takazawa, S. Okihiro, S. Urano and K. Fukui, Free Radic. Res., 2016, 50, 11, 1214-1225.
2） S. Oka, J. Leon, K. Sakumi, T. Ide, D. Kang, F. M. LaFerla and Y. Nakabeppu, Sci. Rep., 2016, 6, 37889, doi: 10.1038/srep37889.
