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島村智子 （tomoko shimamura） 高知大学農学部 |
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島村智子 （tomoko shimamura） 高知大学農学部 |
［Summary］
It is well-known that the Maillard reaction, also called non-enzymatic browning or glycation, is important for the formation of color, aroma, and flavor in food. However, it can cause deterioration of food quality, including generation of mutagenic compounds and loss of nutritional value. Thus, detection of Maillard reaction products is of paramount importance for the quality evaluation of food. This article reviews some of the studies designed to detect the Maillard reaction products such as aminoreductone generated in milk, dihydrofructosazine formed by the self-condensation reaction of glucosamine, and superoxide anion (O2-) produced during the Maillard reaction. All the analyses described here are based on the reduction of tetrazolium salt, especially XTT and WST-1. Rapid and convenient methods for detecting Maillard reaction products with high specificity were made possible using these tetrazolium salts.
キーワード：メイラード反応、テトラゾリウム塩、牛乳、アミノ糖、スーパーオキシドアニオン
メイラード反応 (Maillard reaction) はアミノ酸やタンパク質と還元糖をはじめ不飽和脂肪酸など、食品や生体中に普遍的に存在する基本構成成分の間で起こる反応であり、その影響は多岐にわたっている。例えば、メイラード反応に伴う変異原の生成は食品の0次機能とも呼ばれる安全性に影響を及ぼす。また、糖によるリジン残基の修飾は栄養価の低下を引き起こす。すなわち、食品の1次機能 (栄養機能) に影響を与える。同様に、メイラード反応に伴うフレーバーの生成や褐変物質の生成は食品の2次機能 (感覚機能) へ、また、抗酸化物質等の生成は3次機能 (生体調節機能) へ影響を及ぼすことが知られている。さらに、生体内で糖化を受けたタンパク質の機能低下は疾病の発症要因の1つであると考えられている。従って、メイラード反応は食品系はもとより、生体系も含め最も重要な成分間反応としてみなされ、これまでに非常に多くの研究が行われてきた。
メイラード反応の機構としてはアマドリ転移を経由するHodge経路と、糖の開裂を伴いフリーラジカルを生成するNamiki経路が知られている1)。Hodge経路は初期、中期、終期の3段階に分けられ、初期段階はアミノ化合物のアミノ基と還元糖のカルボニル基が反応してシッフ塩基を形成し、アマドリ転移物へと変化する反応で、この段階の生成物は無色である。中期段階ではアマドリ転移物が2, 3-エノール化した後に1-デオキシグルコソンを形成する経路、あるいは1,2-エノール化した後に3-デオキシグルコソンを形成する経路へと進む。どちらの反応に進むかはpHに依存する。また、二糖類が関与するメイラード反応では、上記の2経路の他に4-デオキシグルコソンへと変化する経路が存在するとの報告がなされている2)。4-デオキシグルコソン経路は単糖類が関与するメイラード反応では確認されておらず、二糖類に特徴的な反応経路である。終期段階になると、それまでの反応で生じたジカルボニル化合物、不飽和カルボニル化合物、フルフラール類などがさらにアミノ化合物と反応したり、中間生成物間の重合が生じたりして、褐変物質 (メラノイジン) が形成される。メラノイジンの構造については、近年でも、数多くの研究が行われているが、その全貌はいまだ明らかでない。Hodge経路と並ぶもう1つの反応経路であるNamiki経路ではシッフ塩基の形成後、逆アルドール縮合で生じる炭素数2または3のジカルボニル化合物がメラノイジンの形成に関与する。メイラード反応はあらゆる食品中で起こり得るものであるが、全ての食品でメラノイジンの形成までメイラード反応が進行しているわけではない。従って、加熱食品中に存在する物質、およびその濃度は大きく異なっている。それゆえ、分析法も生成物に応じて使い分けなければならず、実に様々な分析法が開発され、報告されている1)。
牛乳は均質化後に、衛生学的品質を確保するため、また保存性を向上させるために加熱殺菌される。現在は62〜65℃で30分以上の低温長時間 (LTLT) 殺菌、72〜75℃で15秒間の高温短時間 (HTST) 殺菌、あるいは120℃以上で数秒間の超高温加熱処理 (UHT) を施された牛乳が市販されている。生乳の加熱殺菌はオフフレーバーなどの生成をもたらし、風味に影響を及ぼすことが知られている。実際に流通している牛乳の風味の差異は原料である生乳の差異にも一部起因しているが、加熱条件の違いが大きな要因であると考えられており、加熱強度と官能特性および香気特性との関連を論じた研究も数多く見られる。このオフフレーバーの生成にはメイラード反応が深く関わっている。もちろん、メイラード反応が加熱乳に及ぼす影響はオフフレーバーの生成だけではなく、ラクトースによるリジン残基の修飾に伴う栄養価の低下、抗酸化物質の生成、褐色物質の形成、タンパク質の重合など広範囲にわたっており、その影響はプラスとマイナスの二面性を持ち合わせている3)。メイラード反応は加熱時間と加熱温度に依存して進行するので、加熱乳に施された熱処理のマーカーとしての利用も品質評価上、重要である。このような観点から、牛乳中のメイラード反応生成物を検出する方法がこれまでに数多く開発されてきた。その中でも、フロシンとヒドロキシメチルフルフラールは加熱処理の程度に応じて増加することが明らかとなっており、信頼性の高い方法として知られている1)。しかしながら、その測定には長時間を要したり、複雑な前処理が必要であったりするため、実際の製造工程の管理を目的とした加熱マーカーとして利用することは困難である。
上記のような背景から、著者らは水溶性テトラゾリウム塩XTT (Fig.1) を用いた牛乳のメイラード反応生成物の簡易・迅速検出法の開発を行い、XTT法が牛乳の加熱処理の識別に利用できること、また貯蔵条件の推定に実用的に利用できることを報告してきた4-8)。その内容を以下に紹介したい。
XTT法の測定手順は、マイクロプレート上において、試料40μLとメナジオンを飽和させた0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で調製した0.5mMXTT溶液60μLを混合直後に波長492nm(リファレンス波長600nm)の吸光度を測定し、20分間反応後に再度吸光度測定を行うというものである。この20分の吸光度変化を各試料のXTT還元性とする。この手法を用いてLTLT乳 (65℃で30分間の加熱殺菌)、UHT乳(130℃で2秒間)、ならびにLL(ロングライフ)牛乳(140℃で3秒間) のXTT還元性を評価した結果をFig.2に示した。また、LL牛乳を4℃と37℃で貯蔵し、経時的にXTT還元性を測定した結果をFig.3に示した。図を見て明らかなように、XTT還元性は牛乳の加熱殺菌温度に依存して増加しており、XTT法を用いることで牛乳の熱履歴評価が可能であることが明らかとなった。また、牛乳の示すXTT還元性は貯蔵日数の経過に伴い低下した。その低下速度は貯蔵温度が高いほど速くなった。このことから、XTT法により牛乳の貯蔵条件を推定することも可能であることが示された。牛乳の熱履歴評価法には、同じく牛乳の還元性を利用したフェリシアナイド還元法で求められるタンパク還元価も知られているが、タンパク還元価は加熱殺菌温度を反映する一方で、貯蔵期間中には変化が認められず、XTT法とは異なる挙動を示すことが明らかとなった7)。すなわち、XTT還元性物質は従来法では検出し得ない物質であることが示された。
XTT法の実用化をはかるためには、牛乳中において生成し、かつXTT還元能を有するメイラード反応生成物の特定が必要不可欠である。そこで、牛乳のモデル系としてラクトースとアミノ化合物からなる溶液を使用し、ラクトース関与のメイラード反応において生成するXTT還元性物質の解明に取り組んだ6,8)。その研究過程において、ラクトース-アミノ化合物の加熱溶液は320nmに特徴的な極大吸収を示すことが判明した。Fig.4は100℃で15分間加熱したラクトース−ブチルアミン溶液にXTT溶液を添加した際のスペクトル変化を示している。XTT添加前には320nmの極大吸収のみが認められたのに対して、XTTを添加すると、320 nmの吸収が急速に減少し、その一方で470nm付近の吸収が時間の経過に伴い増加した。この結果は、XTTの添加により320nmの吸収を示す物質が酸化されて減少し、同時にXTTが還元されてホルマザンに変化し発色したことを示すものである。また、同モデル溶液を80-100℃で0-15分間加熱した試料のXTT還元性と320 nm の吸光度の間には、相関係数0.967(n=19)の極めて高い直線性が認められた。このことから、XTTの還元に対する320nmの極大吸収を有する物質の深い関与が示唆された。そこで、本物質の精製を行い、NMR分析を行ったところ、Fig.5に示した構造を有するアミノレダクトンが同定された5)。このアミノレダクトンは二糖類のメイラード反応においてのみ進行する4−デオキシオソン経路で生成する物質である9)。以上の研究結果をもとに、XTT法による牛乳中のメイラード反応生成物検出の原理をFig.6のように提案した。すなわち、(1) 牛乳の加熱殺菌によりラクトースとタンパク質のアミノ基(N末端，あるいはリジン残基のε-アミノ基など)との間でメイラード反応が生じ、アマドリ転移物が形成される。(2)アマドリ転移物からガラクトース部位が脱離した後、4-デオキシグルコソンの生成を経て、タンパク質上にアミノレダクトン構造が形成される。(3) XTTが添加されることにより、アミノレダクトンが酸化される。その一方で、XTTは還元されてホルマザンを生成するというものである。(1)と(2)の反応は加熱殺菌温度と時間に依存して進行することから、XTT法による牛乳の熱履歴評価が可能になると考えられた。また、貯蔵期間中に認められたXTT還元性の低下は、Fig.6中の(4)の過程に示したように、牛乳に内在するCu2+の作用(牛乳中の銅濃度は30μg/L)によりアミノレダクトンが酸化されて減少することに起因していると考えられた。試料の前処理を行うことなく比較的初期段階に生成するアミノレダクトンを検出することのできる本法は、利便性が高く、牛乳の製造管理、ならびに品質評価に利用可能であると考えられる。加えて、本法によって得られる情報は、牛乳中の複雑なメイラード反応機構の解明に対して、新しい知見をもたらすものと期待される。
グルコサミンは天然に広く分布し、プロテオグリカンの形で軟骨など多くの動物組織に存在するアミノ糖である。このグルコサミンの硫酸塩は1980年代からヨーロッパにおいて変形性関節症の治療薬として使用されていたが、近年、グルコサミン塩酸塩でも同様の治療効果が得られるとの報告がなされた10)。変形性関節症の治療法は対症療法が主であったため、軟骨組織を修復する作用を有するグルコサミンは画期的な物質として認識されるようになってきている。グルコサミン塩酸塩は比較的安価であること、また微生物を用いた変異原性試験やラットを用いた急性毒性試験もクリアしていることから、最近では日本でも関節の機能維持を目的とした栄養補助食品として市場に広く流通している。グルコサミンの有用性が注目される一方で、グルコサミンをはじめとする各種アミノ糖が高いDNA切断能を示し、特に、Cu2+の存在下でその切断能が高くなることが報告されている11)。グルコサミンは酸性条件下では安定であるが、中性付近のpHでは極めて安定性が低く、容易に自己重合反応 (一種のメイラード反応) を生じ、含窒素複素環化合物を生成する。この自己重合反応生成物の1つであるジヒドロフルクトサジンがDNA切断能の発現に関与していることが明らかとなっている11)。
グルコサミン塩酸塩 (0.2、0.5、1.0M)を0〜24時間、37℃でインキュベーションした際のXTT還元性の経時的変化をFig.7に示した。グルコサミン反応溶液はXTT還元性を示し、その還元性は反応数時間でピークに達し、その後、低下する傾向を示した。そこで、著者らはグルコサミンの自己重合反応で生成するXTT還元性物質、ならびにその還元機構の解明に取り組んだ12)。37℃で4時間反応させたグルコサミン溶液のHPLCクロマトグラムをFig.8に示した。クロマトグラム上には主要なピークA、B、Cが認められた。しかし、HPLC溶出液のXTT還元性を調べたところ、予想に反してピークA、B、CはXTT還元能を有しておらず、XTT還元性は274nmに吸収を示さず、ピークA、B、Cよりも早く溶出される画分(Fraction D)に認められた。そこで、Fraction DのXTT還元性に対するグルコサミンのインキュベーション時間の影響を調べたところ、Fraction DのXTT還元性は反応開始後5時間で最大となり、その後、時間経過と共に減少する傾向を示した(Fig.9)。この挙動はFig.7と酷似していたことから、XTT還元物質はFractionDであると考えられた。また、Fraction Dを分画後に再インキュベーションした溶液をHPLC分析したところ、そのクロマトグラム上にはピークA、B、Cが出現したことから、FractionDはピークA、B、Cの前駆体であることが判明した。さらに、XTTとFractionDを反応させた後の溶液をHPLC分析したところ、ピークAが検出された。従って、FractionDはXTTに酸化された後、ピークAの物質に変化することが明らかとなった。続いて、各生成物のLC/MS、FAB/MS、NMRによる構造解析を行った。その結果より、ピークA、B、CおよびFractionDの分子量はそれぞれ、320、304、304、322であることが明らかとなった。また、既報13)とのNMRシグナルの一致から、ピークAはフルクトサジン、ピークCはデオキシフルクトサジンであることが判明した。ピークBとFraction Dはその不安定さゆえにNMR分析を行うことはできなかったが、分子量が320であること、XTTの添加に伴う酸化によってフルクトサジンに変化することから、Fraction Dはフルクトサジンの前駆体であるジヒドロフルクトサジンであると考えられた。ピークBに相当する物質についての報告はなされておらず、その構造を明らかにすることはできなかった。
以上の結果を総合して、グルコサミン自己重合物によるXTT還元機構をFig.10のように提案した。すなわち、(1)2分子のグルコサミンが自己重合(一種のメイラード反応)してジヒドロフルクトサジンが生成する。(2)ジヒドロフルクトサジンは溶存酸素により酸化されて、フルクトサジンへと変化する。
しかし、XTTが共存する場合は、XTTにより即座にフルクトサジンへと酸化される。その一方で、XTTは還元されてホルマザンへと変化する。本研究においてXTT法により検出可能であることが判明したジヒドロフルクトサジンは、グルコサミン(および各種アミノ糖)のDNA切断能に深く関与している物質であることが報告されている11)。従って、XTT法はグルコサミンをはじめとする各種アミノ糖の自己重合反応のモニタリングだけでなく、そのDNA切断能の評価にも利用可能であることが明らかとなった14)。
生体内メイラード反応、すなわち、生体内で生じるアミノ化合物とカルボニル化合物の非酵素的褐変反応は糖尿病、白内障、アルツハイマー病といった様々な病気につながるタンパク質の損傷を引き起こすと考えられている15)。さらに糖尿病では、メイラード反応によりスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) の活性が低下することから、酸化ストレスに対する防御能も低下し、様々な合併症を引き起こすことが知られている。例えば、白内障は水晶体が活性酸素による攻撃から保護されなくなった結果生じる合併症のひとつである。また、メイラード反応で修飾を受けたタンパク質によってスーパーオキシドアニオン (O2-) が生成されることが知られており、このO2-が組織の損傷に関係していると考えられている。従って、メイラード反応やそれに伴い生成するO2-と様々な疾病との関係を解明する為には、O2-の検出が不可欠である。生体内メイラード反応に伴うO2-の測定には、従来、分光法のシトクロムc法やニトロブルーテトラゾリウム法、化学発光法、電子スピン共鳴法などが用いられてきた16)。しかしながら、従来法にはO2-に対する特異性が低い、不溶性ホルマザンが生成される、高価な機器を必要とするなどの欠点がある。そこで、これらの欠点を解決するため、分光学的なO2-の発色プローブとして、これまでにSOD活性の測定に利用されてきた高水溶性テトラゾリウム塩WST-116) (Fig.11) を生体内メイラード反応において生成するO2-の検出に適用した17)。その内容の一部を以下で紹介する。
生体内メイラード反応の関連物質であるDL-グリセルアルデヒド、またはグリコールアルデヒドとNα-アセチルリジンを37℃で2日間インキュベーションした溶液0.4 mL に 2 mM WST-1溶液 (pH 7.0のリン酸塩緩衝液で調製) 1.0 mLを添加し、10分間隔で60分間にわたり438 nm の吸光度を測定した結果をFig.12に示した。測定の結果より、DL-グリセルアルデヒドとグリコールアルデヒドの両方の系において、WST-1の還元型ホルマザンに由来する吸光度の増加が認められることが明らかとなった。
そこで、この発色が試料中に存在するO2-による還元作用によるものであるか否かを確認するため、測定系にSODを添加したところ、DL-グリセルアルデヒドの系で93%、グリコールアルデヒドの系で86%の発色が阻害された (Fig.12)。SODと同様にO2-のスカベンジャーとして知られているTironを添加した場合にも、SOD添加時と同程度の発色の阻害が認められた。このことから、WST-1の発色のほとんどがメイラード反応に伴って生成したO2-に依存していることが示唆された。同様の実験をシトクロムcで行ったところ、シトクロムcの吸収はSODやTironの添加で、21〜40%しか阻害されなかった。このことから、メイラード反応系のO2-の検出においても、WST-1がシトクロムcよりも優れた発色プローブであることが明らかとなった。O2-に対する特異性が高いWST-1を用いることにより、生体内メイラード反応で生成するO2-の正確な検出、および定量を行うことが可能となり、疾病との関連をより詳細に調べることができるようになるものと期待される。
食品中、あるいは生体内で生じるメイラード反応の概要、ならびに著者らが報告してきたテトラゾリウム塩を利用したメイラード反応生成物の検出法についての概要を紹介した。メイラード反応は極めて複雑で、今現在でも未知の部分が多いが、それゆえ興味を惹かれる反応でもある。今後は、上記で紹介した検出法を駆使しながら、メイラード反応機構の解明に取り組みたい。
参考文献
1) 受田浩之、石井利直、FFIジャーナル、171、84-91 (1997).
2) M. Pischetsrieder and T. Severin: In “Chemical markers for processed and stored foods” eds. T.-C. Lee and H.-J. Kim, Washington, DC, ACS Symposium Series, pp. 14-23 (1996).
3) M. A. J. S. van Boekel, Food Chem., 62, 403-414 (1998).
4) H. Ukeda, Y. Goto, M. Sawamura, H. Kusunose, H. Kamikado, and T. Kamei, Food Sci. Technol., Int., 2, 48-50 (1996).
5) H. Ukeda, T. Shimamura, T. Hosokawa, Y. Goto, and M. Sawamura, Food Sci. Technol., Int., 4, 258-263 (1998).
6) T. Shimamura, H. Ukeda, and M. Sawamura, J. Agric. Food Chem., 48, 6227-6229 (2000).
7) 島村智子、受田浩之、沢村正義、日本食品科学工学会誌、48、840-843 (2001).
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9) C. Schoetter, M. Pischetsrieder, H. Lerche, and T. Severin, Tetrahedron Lett., 35, 7369-7370 (1994).
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11) N. Kashige, T. Yamaguchi, N. Mishiro, H. Hanazono, F. Miake, and K. Watanabe, Biol. Pharm. Bull., 18, 653-658 (1995).
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13) K. Sumoto, M. Irie, N. Mibu, S. Miyano, Y. Nakashima, K. Watanabe, and T. Yamaguchi, Chem. Pharm. Bull., 39, 792-794 (1991).
14) T. Shimamura, A. Takamori, H. Ukeda, S. Nagata and M. Sawamura, J. Agric. Food Chem., 48, 1204-1209 (2000).
15) N. Ahmed, Diabetes Research and Clinical Practice, 67, 3-21 (2005).
16) 受田浩之、Dojin News、112、1-8 (2004).
17) H. Ukeda, T. Shimamura, M. Tsubouchi, Y. Harada, Y. Nakai, and M. Sawamura, Anal. Sci., 18, 1151-1154 (2002).
| 氏名 | 島村智子 (Tomoko Shimamura) |
| 所属 | 高知大学農学部 |
| 連絡先 | 〒783-8502 高知県南国市物部乙200 E-mail: tomokos@kochi-u.ac.jp |
| 出身大学 | 愛媛大学大学院連合農学研究科 |
| 学位 | 博士（農学） |
| 研究テーマ | メイラード反応の機構解明、地域資源の有する機能性の解明 |
