分子シャペロンと蛋白質の変性・凝集・再溶解

(Molecular chaperones and protein denaturation, aggregation, and disaggregation)

[ Summary ]

Proteins are subjected to conformational transitions in cells. Among them, unfolded state is located at the central position where the paths are crossed to folding into native structure, transport to organella, secretion to outside, formation of aggregates, and so on.
Aggregates are troublesome to the cell in general. There are three kinds of aggregates. Good aggregates can be rescued to the native protein by aid of molecular chaperones. Manageable aggregates cannot restore the native structure but can be digested by proteases.
Difficult aggregates have some ordered structures, are resistant to protease digestion and are accumulated in the cell which sometime cause cell death. I introduce here our recent experiments on how to molecular chaperones rescue good aggregates and how difficult aggregates grow.

キーワード：
Protein aggregate, prion, amyloid, chaperone, Hsp,

1.細胞の蛋白質の一生の新しい描像

　過去約10年の研究によって、細胞の中の蛋白質の運命についてのわれわれのイメージは大きく変化しつつある。蛋白質は、ポリペプチドとして合成されれば、あとは間違いなく、自分自身で機能的な高次構造（ネイティヴな構造）を形成し、所定のところに出向いて、細胞の要求にこたえる役割を果たし、確率的に壊れていく。こういういささか牧歌的な概念は過去のものとなった。高分子重合体としての蛋白質はリボソームでポリペプチドが出来上がった瞬間にすでに完成している。しかしこれは、役立つ蛋白質となるための単なる出発点であって、ゴールではない。ポリペプチドは細胞の中で、自力で、あるいは他の因子に助けられて、なんとか機能的構造を獲得して一人前の蛋白質になる。この構造形成の過程で脱落するポリペプチドも少なくない。その後、細胞内を移動して特定のコンパートメントに入り込む段になると、蛋白質はいったん高次構造がほどける必要がある。そして、あらかじめ予定された場所にたどりついて定着し、やっと求められる機能を発現することになる。しかし、その後もいろいろな機会に障害が生じ、高次構造は損傷を受ける。損傷蛋白質は、場合によっては修復されて快復し、手におえなければ分解されて消滅する。細胞には、こうした蛋白質の一生のすべての過程を、絶えず監視し、制御する巧妙で精緻なシステムが備わっていることが明らかになってきた。

2.分子シャペロンと蛋白質の凝集

　細胞内の蛋白質の運命に関するこのような認識の変化をもたらした契機として、まず、分子シャペロンの発見があげられる。分子シャペロンは、細胞内で新たに合成されたポリペプチドの折れたたみ（フォールディング）や集合（アセンブリー）、細胞の中で生じた変性蛋白質の再生に働く。たとえば、リボソームで合成された直後の新生ポリペプチドはまだ高次構造を形成していないので、疎水性アミノ酸残基が分子表面に露出して凝集しやすい。このような疎水性部分に様々なシャペロンが一過的に結合して、正しい折れたたみに導くことが示されている。大腸菌の場合、全蛋白質の少なくとも1割は分子シャペロンの助けを借りて活性のあるきちんとした立体構造（ネイティヴな構造）に至るという。この新しい「蛋白質の一生」の描像の中で、重要な意義を持つものとして見直されてきたのが、アンフォールドした蛋白質であり、蛋白質の凝集である。アンフォールドした蛋白質とは、ネイティヴな構造が大きく、あるいは完全に壊れて、ヒモ状の構造になった蛋白質のことである。いわば、生まれてきたままの姿の蛋白質と言えようか。蛋白質はアンフォールドした形を経過していろいろな次のステップに進むのは上に述べたとおりで、いわば蛋白質の遷移の中央交差点にあたる。しかし、アンフォールドした蛋白質はそのままにしておけば凝集して沈殿する。この沈殿は、蛋白質を研究するものにとっては、こうなってしまったら蛋白質は意味がないもので、いままでまともな研究の対象にならなかった。しかし、近年これが細胞に重大な損傷を与え、ひいては多くの中枢神経系の変性による病気を引き起こしていることがわかってきて、にわかに真剣な研究が非常な熱心さをもって進められるようになった。そして、ここでも、分子シャペロンが関わっていることが見え始めた。この稿では、蛋白質の凝集とその脱凝集（再溶解）および分子シャペロンとの関わりについて述べる。

3.良い凝集、処理できる凝集、どうにもならない凝集

　細胞が高温などのストレスにさらされると、分子シャペロンは蛋白質の不可逆的な変性を防ぐべく活躍すると考えられるが、ストレスが強ければそれでも凝集が生じるのは避けがたい。しかし、細胞はそれでただちに死ぬわけではない。たとえば、酵母を高温にさらすと、細胞の中に点々と蛋白質の凝集が出現するが、適温にもどせば凝集は消失し、酵母は再び活動を始める^1）。この場合、凝集した蛋白質は、後述のように分子シャペロンによって再び活性のある構造を回復すると考えられる。これは、「良い」凝集である（Fig.1）。しかし、高温にさらす時間が長くなると、凝集はさらにすすみ大きな塊となり、酵母は死んでしまう。ゆで卵状態である。今のところ誰もゆで卵を生卵にもどすことはできない。しかし、ゆで卵は胃袋に入れば消化される。つまり、プロテアーゼで分解される。再生は難しいがプロテアーゼによって分解される凝集は、なんとか「処理できる」凝集である。しかし、もっと悪い「どうにもならない」凝集も存在する。分子シャペロンによっても回復しないし、プロテアーゼによっても分解されない凝集である。

4.「良い凝集」の脱凝集と再生

　さて、凝集をときほぐして水に溶ける形にもどし、さらに再生するにはどうしたらいいだろうか。人工的には、凝集を高濃度の尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤（溶解剤）に溶かし、次に変性剤を透析などで徐々に除いていくと蛋白質の構造と機能が回復する（ただし、これもいつもうまくいくとは限らない）。細胞の中では分子シャペロンがこの作業にあたることが、最近になってわかってきた。以下に私たちの研究を紹介する^2-4）。

　私たちは好熱菌Thermus thermophilusのDnaKの研究をしていた。DnaKはストレス蛋白質であるHsp70ファミリーに属し、DnaJおよびGrpEと協同してATPを加水分解して、蛋白質の凝集阻止や、適当な条件のもとでの変性からの再生を助ける働きがある。このDnaKの遺伝子をクローニングして近くの領域を見てみると、DnaJやGrpEの遺伝子がすぐ近くにあるのは当然として、ClpBという分子シャペロンの遺伝子も同じオペロンに存在していた。同じ転写調節を受けているからには、その作用もお互いに協調しているのではないかと推定し、いろいろ調べてみると、たしかにこの4つの蛋白質（ClpB, DnaK, DnaJ, GrpE）は、高温で変性し凝集した蛋白質の再可溶化（脱凝集）と再生に協調して働いていることがわかった。乳酸脱水素酵素を73℃で30分熱すると変性し遠心すれば沈殿となる（Fig.2 A、lanes 1 and 2）。これを（遠心しないで）55℃に温度を下げて同時に上記4蛋白質を加えると、活性が20％ほどもどってくるのである（Fig.2 B、lanes 4）。73℃の時にDnaK, DnaJ, GrpEとATPを加えておくと、変性は避けがたいが凝集はある程度抑えられて（Fig.2 A、lanes 3）、55度に温度を下げた時にClpBを加えると活性は80％ももどる（Fig.2 B、lanes 2）。ClpBには、このような凝集阻止作用はなく（Fig.2 A、lanes 7 and 8）、DnaKなどと共存させるとかえってその凝集阻止作用を打ち消してしまう（Fig.2 A、lanes 3 and 9）。同じころ米国のLindquistたちも酵母のHsp104（ClpBのファミリー）とHsp70のセットで脱凝集が起こることを実証し^5）、また少し遅れて、ドイツのBukauたちも大腸菌で私たちと似た結果を報告した^6）。こうして、分子シャペロンHsp104/ClpBとHsp70/DnaKの組み合わせによる凝集蛋白質の脱凝集が原核生物と真核生物の両方で確認された。

　では、これらの分子シャペロンはどのように凝集から蛋白質をときほぐしフォールディングを可能とするのだろう。残念ながらその機構についてはまだほとんどわかっていない。凝集体から蛋白質を1本ずつ引き出すのだろうか、それとも、変性剤のように凝集体の中にもぐりこみお互い同士を結合している力を弱めて可溶化するのだろうか。確証はないが凝集体にまず取りつくのはおそらくClpBだと考えられるが、ClpBは6量体のリング構造の分子であって、AAA-ATPアーゼというファミリーに属する蛋白質である。このAAA-ATPアーゼファミリーのメンバーの中には、ATPのエネルギーでポリペプチド鎖やDNA鎖をその中央の穴の中に糸通しのように引き込んで送る活性が想定されているものがある。そこから類推すれば、ClpBは凝集体に結合して、露出したポリペプチド鎖を見つけてそれを引きずり出す、という活動をしているのかもしれない。ClpBのATP加水分解の活性中心に変異を導入した変異体では、脱凝集活性はなくなる。ClpBの6量体リングは反応の間中ずっと安定なものではなくリングを開いたり、サブユニットが相互に回転したりする可能性も考えられる。ClpBとDnaKがどのように任務分担をしているのかもまだわからない。いまのところ、ClpBとDnaK系のシャペロンの作用を分離することには誰も成功していないのである。ただ、この2つの分子シャペロンの活動で、凝集していた蛋白質は自分でフォールディングできる状態になったところで溶液中に放出されるようである。完全にフォールディングして活性を取り戻してから溶液中に放出されるのではないらしい。

5.どうにもならない凝集

　これは単に蛋白質のポリペプチド鎖がからまりあった凝集ではない。構造を持った凝集である。ふつう、蛋白質は、さまざまに配置されたαヘリックスとβシートという2種類の単位構造とこれをつなぐループからなる立体構造を持っている。αヘリックスは、アミノ酸配列上ひとつながりの領域が螺旋状に巻いて出来る構造であるが、βシートはアミノ酸配列上離れた2つの領域がほぼ平行に（あるいは逆平行に）並んで結合した構造である。したがって、αヘリックスは1つの蛋白質の内部で出現する構造であるが、βシートは2つの蛋白質の境界に形成されることもありうる。事実、蛋白質複合体のサブユニット間に分子間βシートが存在し、サブユニット同士の結合を安定化している例は少なくない。多数の蛋白質が次々と分子間βシートで結合すれば線維状の凝集体となる。これは、構造を持った凝集体であり、きわめて安定である。そもそも、何本ものポリペプチドが並んで1つの湾曲した壁のようになった（あるいは一周して樽のようになった）βシートを持つ蛋白質は非常に安定であることが知られている。たとえば、細胞生物学などで便利な目印蛋白質として頻用される緑色蛍光蛋白質は、そのような蛋白質であり、熱にも変性剤にも安定で、生化学でよく使われるSDSゲル電気泳動でもその緑の蛍光を失わない。したがって分子間βシートで結合した線維状の凝集体が非常に安定なのは想像に難くない。いったんこれが生体の中に生じると、プロテアーゼも歯が立たず、どうにもならないままに蓄積してゆく。アミロイド線維やプリオン線維と呼ばれるものはこうした構造の凝集体であろうと考えられる。

6.プリオン線維の形成機構

　プリオン線維は、まず、線維のタネが生じて、次にこれが成長してゆき、そのうち分裂していくと考えられる。したがって、（A）タネとはどんなものでどのように形成されるのか、（B）どのように成長するのか、（C）どんなことをきっかけにして分裂がおこるのか、ということが問題になる。

　（A）については、タネは、これに付加成長してできてくる線維の部分と構造的に区別がつかないらしい。したがって、タネの中のプリオン蛋白質の一つ一つの構造は、線維の中のそれと同じ構造であり、タネというのは単にまだ小さくて可溶性のオリゴマーであろう、と考えられる。あるいは、タネは線維と違った構造のオリゴマーではあるが、これが線維に成長すると線維と同じ構造に変化する、という可能性もある。線維の生成は、時間とともに直線的に進むのではなく、しばらく何もできないように見える期間（lag phase）の後にどっと進行することがわかっている。凝集反応は一般的にn次反応であるから、上記のどちらの考え方でもlag phaseを説明できる。プリオンの毒性は、線維よりむしろこのタネにあるとする考えもあり、タネの構造や生成についての研究は重みを増しているが、まだ確かな知見は少ない。

　（B）については、私たちの研究を後で紹介するとして、（C）について説明しておこう。毒性をもたない正常なプリオン蛋白質は、タネを形成できないが、既存のタネに付加して線維を成長させることはできると考えられる。たとえ異常プリオンのタネが細胞に侵入しても、そのタネだけが線維に成長するのであれば、線維の数はたかがしれていてそれだけでは細胞に問題を起こさないだろう。しかし、線維がちぎれて何本かに分裂してそれが（正常なプリオン蛋白質の付加で）また成長するとしたら、これは線維の自己増殖であり、プリオンの感染性を説明できる。しかし、肝心な分裂にかかわる因子は不明である。酵母の場合には、プリオン様蛋白質Sup35のプリオン的な表現型は、前述のHsp104で制御されることが知られている。すなわち、Hsp104の量が過少でも、過多でも、プリオンの表現型は現れない^7）。前述のように、Hsp104は凝集した蛋白質を脱凝集する力がある。これが過少な時は、線維の分裂がおきないので増殖できない。これが過多な時は、タネが脱凝集されてなくなってしまうのでプリオン線維はできない。Hsp104がちょうど良い濃度の時には、Hsp104はタネの形成は妨害せず線維の分裂だけを触媒する。今のところ、そう解釈されている。

　（B）の線維の成長については、私たちの研究を紹介する^8）。酵母のプリオン様蛋白質Sup35の線維形成ドメインであるSup35NMの末端にヒスチジンタグとシステインを導入し、そのSH基に赤い蛍光、緑の蛍光、あるいはビオチンを付加した。Sup35NMを、塩酸グアニジン溶液から希釈して放置すると、モノマー（水可溶性のSup35NMがモノマーである確証はないがモノマーと仮定しておく）のSup35NMから数時間かけて徐々に線維ができて成長し始める。まず、赤いSup35NMで線維を作った。

　次に、緑のSup35NMモノマーを加え放置して再び線維を成長させた後に、線維をガラス基盤に固定し、蛍光顕微鏡で観察した。すると、赤い線維の先に緑の線維が成長した2色からなる線維がはっきりと見えた。赤い線維の片側に緑の線維が成長したケース、両側に成長したケースの2通りがあったが、前者が圧倒的に多数（97％）であった（Fig.3）。他に、緑だけの線維が多数あった。これは、後から加えた緑のSup35NMモノマーがタネを生じて線維になったものであり、長さが短い。赤と緑の順番を逆にして、最初に緑の線維を作り、次に赤いSup35NMモノマーを加えた場合も、緑の線維の片側に赤い線維が成長する片方向成長が優勢であった。あらかじめ緑の線維をガラス基盤に固定し、そこに赤の線維が成長していくようすを時間を追って観察することも出来た。その場合も、片方向成長が70％を占めた。初めの線維をあらかじめ超音波処理して細かく分断して新しい成長末端を露出させてから次の成長をさせても、片方向成長優勢な結果は変わらなかった。これは、成長中の線維の末端がたまたま閉じられることがあり、その後に次のモノマーを加えたから一見、片方向成長に見える、という可能性は少ないことを示す。

　線維の片側だけが成長することは何を意味するか考えてみる。もし、水に溶けているモノマーのSup35NMは、そのままでは線維に結合できないが、ある確率で構造変化を起こし、その結果、線維の先端に結合できるようになるとする。線維成長が持続するためには、モノマーは、線維に結合するための結合部位だけでなく、線維に結合した後に次にくるモノマーが結合できる受容部位を持たなければならない。したがって、モノマーの構造変化とは、この結合部位と受容部位の両方を生じるようなものである。そうすると、必然的に線維の成長は両方向となるはずである（Fig.4、モデルb）。今度は、モノマーは初めから結合部位を持っているが、受容部位は線維に結合した後に構造変化がおきて生じるとする。そうすると、線維成長は片方向成長とならざるを得ない（Fig.4、モデルa）。構造変化は、モノマーが線維に結合する前に起きるのか、それとも、モノマーが線維に結合してから起きるのか、2つのモデルはそこが違っている。構造変化の引き金は、前者では、水に溶けているモノマーに自発的に起きる確率的なものであり、後者では、線維の先端に結合したことによってモノマーにもたらされた構造の歪みである。私たちの実験結果は、線維先端には、新しく成長先端を形成する触媒活性のようなものがあることを示唆しているように見える。しかし、付け加えておかなければならないのは、両方向成長も皆無ではないことである。ごく少数だが、両方向に等しい速度で成長しているように見える線維もあった。私たちの報告の後、別の研究グループから原子間力顕微鏡でSup35NMの成長方向を調べた論文が発表されたが、やはり、少数の線維は両方向に等しい速度で成長していた。また、片方向成長のものも、少しだけ反対方向に延びているものも多かった。Sup35NMは、単一の成長方式ではなく、いろいろな成長のしかたをするものの混合物である可能性がある。

7.終わりに

　細胞にとって、活性をもつ蛋白質ばかりが大事なのではない。ほどけた状態の蛋白質は、蛋白質の一生の転換点に現れてくる。これをうまく処理しないとやっかいなことになる。特に、凝集してしまうとまずい。それでも凝集が小さくて性質がよいならば、細胞は分子シャペロンを動員してこれを活性ある姿に再生できることがある。再生できなければ、分解すると考えられるが、時には、再生も分解もできない事態が発生する。この時、凝集は不定形というよりも構造を持った結晶のようにふるまって線維を形成する。この線維の形成にも分子シャペロンが関わっている気配が濃厚になってきている。

参考文献

1) Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A. & Lindquist, S., Nature (London), 372, 475(1994).

2) Motohashi, K., Watanabe, Y., Yohda, M., Yoshida, M. Heat-inactivated proteins are rescued by the DnaK.J-grpE set and ClpB chaperones., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7184 (1999).

3) Watanabe, Y., Motohashi, K., Taguchi, H., Yoshida, M. Heat-inactivated proteins managed by DnaKJ-GrpE-ClpB chaperones are released as a chaperonin-recognizable nonnative form, J. Biol. Chem., 275, 12388(2000).

4) Watanabe, Y.-h., Motohashi, K., Yoshida, M., Roles of the Two ATP Binding Sites of ClpB from Thermus thermophilus, J. Biol. Chem., 277, 5804(2002).

5) Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S., Cell, 89, 811(1997).

6) Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13732(1999). 7) Chernoff, Y., O. Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W., Science 268, 880(1995).

8) Inoue Y, Kishimoto A, Hirao J, Yoshida M, Taguchi H. Strong growth polarity of yeast prion fiber revealed by single fiber imaging,. J. Biol. Chem., 276, 35227(2001).