はじめての抗体標識プロトコル-3

図26　Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kitを用いたミトコンドリアの染色例

図27　直接法及び間接法によるELISAの感度比較

図28　リン酸化チロシンBSAのウエスタンブロッティング(TMB発色)

A：直接法(HRP標識抗リン酸化チロシン抗体で検出）

B：間接法(抗リン酸化チロシン抗体とHRP標識二次抗体で検出）

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9 mgのDAB（Code: D006）を1 ml PBSに溶解し、100X DAB溶液を調製する。

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30% 過酸化水素5 μlを1 ml PBSで希釈し、200X過酸化水素溶液を調製する。

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10 μlの100X DAB溶液と5 μlの200X 過酸化水素溶液を1 ml PBSで希釈し、染色溶液とする（染色溶液は保存できないので、用時調製すること）。

・

6 mgのTMBZ(Code: T022)を1 ml DMSOに溶解し、100X TMBZ溶液を調製する。

・

30% 過酸化水素5 μlを1 ml PBSで希釈し、200X 過酸化水素溶液を調製する。

・

10 μlの100X TMBZ溶液と5 μlの200X 過酸化水素溶液を1 ml PBSで希釈し、TMB溶液とする。

図29　精製前後のPeroxidase-IgGのHPLCチャート
＜HPLC条件＞
カラム：TSKgel G3000PWXL φ78×300 mm,
溶離液：100 mmol/l リン酸緩衝液, pH 6.8,
流　速：0.5 ml/min

使用製品：

Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH₂ (Code: LK12)
Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH　 (Code: LK13)

図30　ELISA 実験例

図31　Fab'標識体への酵素標識

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lgG

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ブタ胃ペプシン

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緩衝液A、緩衝液B

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Sephacryl S-200HR(GE ヘルスケア社製)

(1)

lgG 5 mg/0.5 ml を緩衝液A で透析する。

(2)

透析後の試料液にブタ胃ペプシン0.1 ～ 0.2 mg を溶解し、37℃で15～ 20 時間インキュベートする。

(3)

pHを7 に調整して、Sephacryl S-200HR で、緩衝液B を溶離液にして、流速0.35 ml/min でゲル濾過する。

(4)

F(ab')₂ 画分をとり、濃縮する。280 nm における吸光度を測定し、100 mg/ml のアジ化ナトリウムを1％(v/v)添加して保存する。

(5)

MW=92,000、 ε_{280 nm}=1.48 g^-1・L・cm^-1を用いて濃度を算出する。タンパク質濃度(mg/ml)={A_{280 nm}/(1.48×MW)}×MW=A_{280 nm}/1.48 またはモル濃度(mol/l)= A_{280 nm}/(1.48×MW) に基づ いて計算する。

・

F(ab')₂

・

緩衝液C、緩衝液D

・

0.1 mol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液(11.36 mg の2-メルカプトエチルアミン塩酸塩を緩衝液D 1 ml に溶解する。

(1)

0.1 ～ 3 mg のF(ab')₂ を含む緩衝液C 0.45 ml に、2-メルカプトエチルアミン溶液50 μl を添加する。

(2)

37℃で90 分間インキュベートする。

(3)

Ultrogel AcA44 カラムで、緩衝液D を用いて流速0.35 ml/min でゲル濾過する。

Fab' 画分をとり280 nm の吸光度を測定し、MW=46,000、ε_{280 nm}=1.48 g^-1・L・cm^-1 に基づいて濃度を算出する。

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仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ

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緩衝液E、緩衝液F

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EMCS(製品コード: E018)

・

Sephadex G-25(GE ヘルスケア社製)

(1)

アルカリホスファターゼ(2 mg)/ 緩衝液E 0.5 ml を同じ緩衝液E を外液にして透析する。

(2)

試料液にEMCS(0.17 mg)/DMF 10 μl を添加して、30℃で30 分間インキュベ－トする。

(3)

Sephadex G-25 カラム(1×45 cm) で、緩衝液F を溶離液にしてゲル濾過し、濃縮する。

マレイミド量とアルカリホスファターゼ活性を測定する。

・

マレイミド導入アルカリホスファターゼ

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Fab'

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緩衝液D, 緩衝液G, 緩衝液F

・

10 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン(緩衝液D 溶液)

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アジ化ナトリウム

(1)

マレイミド導入アルカリホスファターゼ1 mg(10 nmol) を緩衝液F 0.25 ml に溶解し、Fab' 2.3 mg (50 nmol)/ 緩衝液D 溶液0.25 ml を混合する。

(2)

4℃で20 時間インキュベートする。

(3)

10 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン溶液10 μl を添加し、Ultrogel AcA44 カラムでゲルろ過する。溶離液には緩衝液G を用い、流速0.35 ml/min で溶離する。

アルカリホスファターゼ活性(3)-4.) を測定し、100 mg/ml BSA と100 mg/ml のアジ化ナトリウムをそれぞれ1％(v/v)添加し保存する。

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マレイミド導入アルカリホスファターゼ

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緩衝液C

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0.5 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液
(0.1 mol/l の2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液10 μl と50 mmol/l EDTA (pH6.0) 2 ml を混合し調製する。
50 mmol/l EDTA 溶液100 ml 調製には小社2NA(Code: N001) 1.86 g を溶解し1 mol/l NaOHでpH6.0 に調整する。)

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5 mmol/l 4-PDS 溶液(4-PDS (Code: P017)1.1 mgを緩衝液B 1mlに溶解する)

(1)

マレイミドを導入したアルカリホスファターゼ( 約10 μmol/l)/ 緩衝液C 0.45 ml に、0.5 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン溶液50 μl を添加する。コントロール(全発色)として、緩衝液C 0.45 mlに0.5 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液50 μlを添加したものを用意し、同様に以下の操作を行う。

(2)

30℃で20 分間インキュベートする。

(3)

5 mmol/l の4-PDS 溶液20 μl 加え、30℃で10 分インキュベートし、324 nmの吸光度を測定する。残存チオール量に相当した4-チオピリドン量(ε_{324 nm}=19,800 M^-1・cm^-1)が生成されるため、コントロールとの吸光度差が導入されたマレイミド基量に相当する

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緩衝液H

・

5.5 mmol/l pNPP/ 緩衝液H

・

1 mol/l NaOH

(1)

酵素溶液を、緩衝液H で希釈する。

(2)

酵素希釈溶液0.5 ml を30 ～ 37℃で5 分間インキュベートする。

(3)

5.5 mmol/l pNPP/ 緩衝液H 0.5 ml を添加する。

(4)

30 ～ 37℃で10 ～ 100 分間インキュベートする。

(5)

1 mol/l NaOH 0.5 ml を加えて、反応を停止させ、405 nmの吸光度を測定する。予め既知濃度のアルカリホスファターゼを用いて同一法で活性を測定し、作製しておいた酵素濃度- 吸光度の検量線から定量する。また、酵素量は、280 nmの吸光度より、ε₂₈₀=0.99 cm²・mg^-1 とMW=100,000 よリ算出する。
タンパク質濃度(mg/ml)={A₂₈₀ / (0.99×MW)}×MW=A₂₈₀/ 0.99 またはモル濃度(mol/l)=A₂₈₀ / (0.99×MW) に基づいて計算する。

緩衝液A ：

0.1 mol/l 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5、0.1 mol/lNaCl を含む)

緩衝液B ：

0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)

緩衝液C ：

0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)

緩衝液D ：

0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0, 5 mmol/lEDTA を含む) (EDTA-2Na 塩を緩衝液作製途中で終濃度が5 mmol/l となるよう加え、希釈してリン酸濃度が0.1 mol/l にする。すなわち100 ml 調製には小社2NA(Code: N001) を186 mg 用いる)

緩衝液E ：

50 mmol/l ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH7.6、1mmol/l MgCl₂、0.1 mmol/l ZnCl₂ を含む)

緩衝液F ：

0.1 mol/l Tris-HCl 緩衝液(pH7.0、1 mmol/l MgCl₂、0.1 mmol/l ZnCl₂ を含む)

緩衝液G ：

10 mmol/l Tris-HCl 緩衝液(pH6.8、0.1 mol/l NaCl、1 mmol/l MgCl₂、0.1 mmol/l ZnCl₂ を含む)

緩衝液H ：

0.1 mol/l グリシン-NaOH 緩衝液(pH10.3、1 mmol/l MgCl₂、0.25 g/l 卵白アルブミンを含む)

(1) 試薬

(2)精製方法

図32 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
　　　1: ゼラチン含有IgG溶液
　　　2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬

(2)精製方法

図33 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
　1: IgG
　2: ゼラチン含有IgG溶液
　3: 300K限外濾過のみのIgG溶液
　4: 300K限外濾過+ IgG Purification Kit - Gで精製後のIgG溶液

1)

J. Hirota, S. Shimizu, "Introduction of protein labeling kit", Bull. Natl. Inst. Anim. Health, 2005, 111, 37.

2)

石川栄治, 河合忠, 宮井潔, 酵素免疫測定法 第3 版, 医学書院, 1987.

3)

P. Tijssen 著, 石川栄治訳, 生化学実験法11 エンザイムイムノアッセイ, 東京化学同人, 1989.

4)

P. Cuatrecasas, I. Parikh, "Adsorbents for affinity chromatography. Use of N-hydroxysuccinimide esters of agarose", Biochemistry, 1972, 11(12), 2291.

5)

E. Ishikawa, M. Imagawa, S. Hashida, S. Yoshitake, Y. Hamaguchi, T. Ueno, "Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining", J. Immunoassay, 1983, 4, 209.