02 酸化ストレス関連試薬

NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ~Griess Reagent Kit~

NO<sub>2</sub>/NO<sub>3</sub> Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ~Griess Reagent Kit~

NO検出関連試薬

  • 製品コード
    NK05  NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ~Griess Reagent Kit~
容 量 本体価格 富士フイルム
和光純薬
100回用 ¥30,900 344-07991
キット内容
100回用 ・NaNO2 標準溶液 (100 μmol/L)
・NaNO3 標準溶液 (100 mol/L)
・緩衝溶液 (20 mmol/L、pH 7.6)
・還元酵素
・補酵素
・試薬A
・試薬B
x1
x1
x1
x1
x1
x1
x1

性質

Griess法は一酸化窒素(NO)が酸化されて生じるNO2-によるジアゾニウム塩化合物とナフチルエチレンジアミンのアゾカップリングを利用して検出する方法である。NOを直接測定するものではないが、発生したNO量を簡便に測定できるため広く使用されている。

NOはN2O3あるいはN2O4となり水中で加水分解され最終的にNO2-とNO3-になるのでNO2-と同時にNO3-も測定する必要がある。本キットは還元酵素を含みNO3-をNO2-に還元できるので[NO2-]と[NO3-]の両方が測定できる。
 本キットは10~100 μmol/Lの濃度領域の測定に適している。

測定波長:540 nm(530~580 nmの領域で測定可能。)

 使用方法はプロトコルをご覧下さい。

マニュアル

はじめての抗体標識プロトコル

死細胞数を測りたい(吸光測定)

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST を用いた細胞毒性試験の例を紹介

お役立ち情報

技術情報

キット以外に必要なもの

・マイクロプレートリーダー ・96穴マイクロプレート ・マイクロピペット ・チップ及びシリンジ

*測定試料によっては除蛋白用の装置、試薬も必要となる。

測定原理

参考文献

参考文献を表示する

1) L. J. Ignarro, G. M. Buga, K. S. Wood, R. E. Byrns and G. Chaudhuri, "Endothelium-Derived Relaxing Factor Produced and Released from Artery and Vein in Nitric Oxide", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9265.
2) W. R. Tracey, J. Linden, M. J. Peach and R. A. Johns, "Comparison of Spectrophotometric and Biological Assays for Nitric Oxide (NO) and Endothelium-Derived Relaxing Factor (EDRF): Nonspecificity of the Diazotization Reaction for NO and Failure to Detect EDRF", J. Pharmacol. Exp. Ther., 1990, 252(2), 922.
3) J. S. Pollock, U. Forstermann, J. A. Mitchell, T. D. Warner, H. H. H. W. Schmidt, M. Nakane and F. Murad, "Purification and Characterization of Particulate Endothelium-derived Relaxing Factor Synthesis from Cultured and Native Bovine Aortic Endothelial Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10480.
4) H. H. H. W. Schmidt, T. D. Warner, M. Nakane, U. Forstermann and F. Murad, "Regulation and Subcellular Location of Nitrogen Oxide Synthases in RAW264. 7 Macrophages", Mol. Pharmacol., 1992, 41, 615.
5) S. Archer, "Measurement of Nitric Oxide in Biological Models", FASEB J., 1993, 7, 349.
6) M. B. Gilliam, M. P. Sherman, J. M. Griscavage and L. J. Ignarro, "A Spectrophotometric Assay for NADPH Oxidaton by Aspergillus Nitrate Reductase", Anal. Biochem., 1993, 212, 359.
7) S. Bodis and A. Haregewoin, "Significantly Reduced Salivary Nitric Oxide Levels in Smokers", Ann. Oncol, 1994, 5, 371.
8) D. S. A. Majid, M. Godfrey, M. B. Grisham and L. G. Navar, "Relation Between Pressure Natriuresis and Urinary Excretion of Nitrate/Nitrite in Anesthetized Dogs", Hypertension, 1995, 25, 860.
9) H. Trachtman, B. Gauthier, A. Goldstein and J. Tomczak, "Increased Urinary Nitrite Excretion in Children with Minimal change Nephrotic Syndrome", J. Pediatr., 1996, 128, 173.
10) D. L. Granger, R. R. Taintor, K. S. Boockvar and J. B. Hibbs Jr., "Mesurement of Nitrate and Nitrite in Biological Samples Using Nitrate Reductase and Griess Reaction", Methods in Enzymol., 1996, 268(A), 142.
11) G. Giovannoni, J. M. Land, G. Keir, E. J. Thompson and S. J. R. Heales, "Adaptation of the Nitrate Reductase and Griess reaction Methods for the Measurement of Serum Nitrate Plus Nitrate Levels", Ann. Clin. Biochem., 1997, 34, 193.
12) I. Guevara, J. Iwanejko, A. Dembinska-Kiec, J. Pankiewicz, A. Wanat, P. Anna, I. Golabek, S. Bartus, M. Malczewska-Malec and A. Szczudik, "Determination of Nitrite/Nitrate in Human Biological Material by the Simple Griess Reaction", Clin. Chem. Acta., 1998, 274, 177.

よくある質問

Q

NO2/NO3 Assay Kit-FX(Fluorometric)~2,3-Diaminonaphthalene Kit~との違いは何ですか?

A

主な違いは以下の通りです。詳細は製品情報をご確認下さい。

1.検出方法

  Kit-CⅡは吸光度測定、Kit-FXは蛍光測定です。それぞれ対応したマイクロプレートリーダー等をご利用下さい。

2.測定範囲

  Kit-CⅡは10~100 μmol/LのNO2-/NO3-濃度の測定に、Kit-FXは1~10 μmol/LのNO2-/NO3-濃度の測定に適しています。

3.阻害物質

  フェノールレッドを含む培地は、Kit-CⅡでは使用可能ですが、Kit-FXでは使用できません。

Q

サンプルの前処理方法を教えて下さい。

A

<血清>
除蛋白が必要です。
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane ([UFC801008], Millipore 社) などで除タンパク(例えば7000 xg, 20 min, 4℃) して
測定試料として下さい。

トリクロロ酢酸を用いた除タンパクでも結構です。ただし、酸で除タンパクした場合は、測定前に必ずpHを中性に戻してから使用して下さい。
酵素反応が阻害をうける可能性があります。

<尿>
除蛋白が必要です。血清の除蛋白操作を参考に、除蛋白操作を行って下さい。

<細胞培養液>
遠心分離(例えば1000 xg, 15min, 室温)し、上澄みをサンプルとして下さい。
血清を添加している場合は、除蛋白を行って下さい。
血清のタンパク成分の影響で、NO2-/NO3-濃度が低く出る可能性があります。

<組織> (例:マウス皮膚)
マウス皮膚をホモジナイズ遠心後(例えば、7,740 xg)の上澄みをUltrafree-MC centrifuge device(UFC3; Millipore社)などで
除タンパクして測定試料としてください。

※組織前処理の参考文献:K. Nakai, et al., "Free radical production requires both inducible nitric oxide synthase and xanthine oxidase in LPS-treated skin",
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(12), 4616-4621.

Q

以前、NO2/NO3 Assay Kit-C(Colorimetric) ~Griess Reagent Kit~というものが 販売されていましたが、現在のキットとどのように違うのでしょうか?

A

以前のタイプのものは、サンプルに血清や培地を使用した場合、
NO3をNO2に還元する際の酵素反応に阻害が見られました。
そのため、血清や培地を使用する際はサンプルを3~5倍に希釈するようにしていました。

現在のNO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ~Griess Reagent Kit~ 
は酵素・補酵素を改良することにより、血清や培地を使用する際にも希釈せず
使用できるようにしました。

反応の原理、その他の注意事項は以前と変わりません。
現在のキットでもサンプルの除蛋白は必要ですので、ご注意ください。

Q

サンプル中にZn(亜鉛)などの重金属があると測定値に影響するでしょうか? (アルカリによる除タンパクの際にZnSO4を使用します)

A

影響します。

サンプル中にZnが数百μM以上の濃度で存在するとNO3-は殆ど還元されません。
Znの他に、Cuについても同様の影響が見られます。

ただしこれらの影響は微量金属に対して等量か過剰のEDTAを加えることで
影響を回避することができます。

Q

血液をサンプルとして使用する際の抗凝固剤は何がよいでしょうか?

A

EDTA類をご使用ください。

ヘパリンは必要最低限の量であれば、ほとんど影響ありませんが、

濃度が高くなると発色反応や酵素反応に影響します。

Q

培地を使用する場合、使用できない培地があるということですが、 どのような培地が使用できないのでしょうか?

A

硝酸塩が多く含まれる培地は使用出来ません(RPMI1640など)

*注:[NO2-]のみの測定であれば可能ですが、[NO2-/NO3-]のトータルの濃度測定は出来ません。

Kit-C IIの場合、10~100 μMのNO2/NO3濃度の測定に適しています。
例えば、RPMI1640の場合、NO3が800 μM添加されていますので、測定限界をはるかに超えています。
ブランクとして差し引く場合でも、許容できるとすれば、10~20 μM程度です。

代表的な培地ですと
『MEM』大部分の種類のものが硝酸を含んでおりませんので、
    出来れば硝酸を含んでいないものをお使いください。

『DMEM』硝酸を含んでおりますが、濃度としては1 μmol/L以下程度です。
    これはほぼ無視しても良いレベルなのではないかと考えています。

いずれの培地にしろ(勿論RPMI 1640は除きますが)、やむを得ず硝酸を含んだものをお使いになり、
その影響が気になる場合は、サンプルに含まれる量と同量の培地のみで測定してブランクとして差し引いて頂くと良いです。
培地のカタログに組成表が記載してありますので、測定前にご確認ください。

Q

試料を、前処理する前に保存できますか?

A

 -20℃で保管していただければ、保存は可能です。

-20℃で保管した血清は、凍結前と2ヶ月間凍結した後で、データに差がないことを確認しております。

しかし、試料中にNOxを分解するような物質(微生物など)が含まれると安定性が確保できませんので、ご注意下さい。

Q

測定を阻害する物質は、どのようなものがありますか?

A

硝酸塩が多く含まれる培地(RPM1640など)中では、測定ができません。

詳しくは「使用できない培地は何でしょう?」のQ&Aをご参照下さい。

タンパク質や金属(Fe, Cu, Zn, Ca, Mgなど)が入っていると測定に影響が出ます。

試料は前処理の段階で、除タンパク操作を行って下さい。

金属はキレート剤(EDTAなど)を加えることで影響を回避できます。

詳しくは「金属による測定の影響」のQ&Aをご参照下さい。

取扱条件

取扱条件
1.保存方法:冷蔵
危険・有害
シンボルマーク
感嘆符腐食性

製品分類一覧

分類一覧から探す

お探しの検索ワードを入力してください