Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling KitLK33 取扱説明書

Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit は、10 μg の抗体にペルオキシダーゼを 30 分以内に標識するためのキットです。
Reactive Peroxidase は、活性エステル基を導入したペルオキシダーゼであり、抗体と混合するだけで安定な共有結合を形成します。本キットには標識に必要なすべての試薬が含まれています。

図 1 標識手順

注意 Reactive Peroxidaseはアルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のReactive Peroxidaseはアルミラミジップに入れたままチャックをしっかりと閉め、-20°Cで保存してください。Reactive Peroxidase以外は、0～5°Cで保存してください。

Reactive Peroxidase	x 3
Reaction Buffer	100 μl x 1
Stop Solution	100 μl x 1

0 ～ 5℃で保存してください。
ご購入後、未開封の状態で 1 年間安定です。

• 20 μl マイクロピペッタ－
• マイクロチューブ（サンプル調製用）
• インキュベーター（37°C）
• PBS (Phosphate buffered saline)

• 0.5 ～ 1 mg/ml の抗体溶液を使用してください。抗体濃度が 1 mg/ml を超える場合は PBS で希釈してください。
• 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
• 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、開封前に溶液を遠心等でチューブの底に落としてからご使用ください。
• 抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります。表 1 に標識に影響を及ぼさない添加剤の最大濃度を示しました。

表1. 標識に影響を及ぼさない添加剤の最大濃度

添加劑 Buffering agents (PBS, HEPES) ○ Sodium chloride ○ Chelating agents (EDTA) ○ Sugars (Glucose, Trehalose) ○ Glycerol < 50%

添加劑 Sodium azide < 0.1% BSA* < 1% Gelatin < 0.1% Tris < 50 mmol/l Primary amines and thiols x

• BSA は抗体の種類により非特異吸着の原因となる場合があります。非特異吸着が著しい場合には、標識操作の前に BSA を除去することを推奨します。

1. 抗体量が 10 μg に相当する量の 0.5 ～ 1 mg/ml に調製した抗体溶液をマイクロチューブに入れる。
2. 操作 1 の抗体溶液に Reaction Buffer を加え、ピペッティングにより混合する。
   • Reaction Buffer の添加量 : 抗体溶液の 1/10 量 ( 表 2） 
3. 操作 2 の溶液を Reactive Peroxidase に加え、ピペッティングにより混合する。 
4. 37°Cで 10 分間反応する。
5. 操作 4 の溶液に Stop Solution を加え、ピペッティングにより混合する。
   • Stop Solution の添加量 : 抗体溶液の 1/10 量 ( 表 2） 
6. 室温で 10 分間反応する。 
7. 操作 6 の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。
   • 標識抗体は、4°Cで 2 週間は安定です。長期保存する場合には、等量のグリセロールを添加して、-20°Cで保存してください。

表 2. Reaction Buffer と Stop Solution の添加量

抗体濃度 (mg/ml)	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0
Reaction Buffer 添加量 (pl)	2.00	1.67	1.43	1.25	1.11	1.00
Stop Solution 添加量 (pl)	2.00	1.67	1.43	1.25	1.11	1.00

ミトコンドリアの免疫染色

1. μ- スライド 8 ウェル（ibidi 社製）に HeLa 細胞を播種し、37℃、5% 炭酸ガスインキュベーター内で一晩培養した。
2. 培地を取り除き、PBS で 3 回洗浄後、4% パラホルムアルデヒド / PBS 溶液を添加した。
3. 室温で 1 時間静置した。
4. 上清を取り除き、1% Triton-X / PBS 溶液を添加した。
5. 室温で 30 分間静置した。
6. 上清を取り除き、 PBS で 3 回洗浄後、PBS で調製したブロッキング溶液を添加した。
7. 冷蔵で 1 時間静置した。
8. ペルオキシダーゼ標識 - 抗ミトコンドリア抗体をブロッキング溶液で 50 倍希釈した。
   • 抗ミトコンドリア抗体（商品コード : ab3298）は abcam 社から購入した。
9. 上清を取り除き 8 の溶液を添加した。
10. 冷蔵で一晩静置した。
11. 上清を取り除き、 50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）で 3 回洗浄した。
12. 上清を取り除き、0.2 mg/ml DAB( 同仁化学研究所、品コード：D006)、0.003% H₂O₂、50 mmol/l トリス緩衝液 (pH 7.5) を添加した。
13. 室温で 10 分間静置した。
14. 上清を取り除き、 50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）で 3 回洗浄した後、50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）を添加した。
15. 染色細胞を顕微鏡で観察した。

図 2 HeLa 細胞のミトコンドリアの免疫染色画像