はじめに
Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit は、10 μg の抗体にペルオキシダーゼを 30 分以内に標識するためのキットです。
Reactive Peroxidase は、活性エステル基を導入したペルオキシダーゼであり、抗体と混合するだけで安定な共有結合を形成します。本キットには標識に必要なすべての試薬が含まれています。
図 1 標識手順
注意 Reactive Peroxidaseはアルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のReactive Peroxidaseはアルミラミジップに入れたままチャックをしっかりと閉め、-20°Cで保存してください。Reactive Peroxidase以外は、0~5°Cで保存してください。 |
キット内容
Reactive Peroxidase | x 3 |
Reaction Buffer | 100 μl x 1 |
Stop Solution | 100 μl x 1 |
保存条件
0 ~ 5℃で保存してください。
ご購入後、未開封の状態で 1 年間安定です。
必要なもの ( キット以外 )
- 20 μl マイクロピペッタ-
- マイクロチューブ(サンプル調製用)
- インキュベーター(37°C)
- PBS (Phosphate buffered saline)
使用上の注意
- 0.5 ~ 1 mg/ml の抗体溶液を使用してください。抗体濃度が 1 mg/ml を超える場合は PBS で希釈してください。
- 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
- 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、開封前に溶液を遠心等でチューブの底に落としてからご使用ください。
- 抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります。表 1 に標識に影響を及ぼさない添加剤の最大濃度を示しました。
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- BSA は抗体の種類により非特異吸着の原因となる場合があります。非特異吸着が著しい場合には、標識操作の前に BSA を除去することを推奨します。
プロトコール
- 抗体量が 10 μg に相当する量の 0.5 ~ 1 mg/ml に調製した抗体溶液をマイクロチューブに入れる。
- 操作 1 の抗体溶液に Reaction Buffer を加え、ピペッティングにより混合する。
- Reaction Buffer の添加量 : 抗体溶液の 1/10 量 ( 表 2)
- 操作 2 の溶液を Reactive Peroxidase に加え、ピペッティングにより混合する。
- 37°Cで 10 分間反応する。
- 操作 4 の溶液に Stop Solution を加え、ピペッティングにより混合する。
- Stop Solution の添加量 : 抗体溶液の 1/10 量 ( 表 2)
- 室温で 10 分間反応する。
- 操作 6 の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。
- 標識抗体は、4°Cで 2 週間は安定です。長期保存する場合には、等量のグリセロールを添加して、-20°Cで保存してください。
抗体濃度 (mg/ml) | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
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Reaction Buffer 添加量 (µl) |
2.00 | 1.67 | 1.43 | 1.25 | 1.11 | 1.00 |
Stop Solution 添加量 (µl) |
2.00 | 1.67 | 1.43 | 1.25 | 1.11 | 1.00 |
実験例
ミトコンドリアの免疫染色
- μ- スライド 8 ウェル(ibidi 社製)に HeLa 細胞を播種し、37℃、5% 炭酸ガスインキュベーター内で一晩培養した。
- 培地を取り除き、PBS で 3 回洗浄後、4% パラホルムアルデヒド / PBS 溶液を添加した。
- 室温で 1 時間静置した。
- 上清を取り除き、1% Triton-X / PBS 溶液を添加した。
- 室温で 30 分間静置した。
- 上清を取り除き、 PBS で 3 回洗浄後、PBS で調製したブロッキング溶液を添加した。
- 冷蔵で 1 時間静置した。
- ペルオキシダーゼ標識 - 抗ミトコンドリア抗体をブロッキング溶液で 50 倍希釈した。
- 抗ミトコンドリア抗体(商品コード : ab3298)は abcam 社から購入した。
- 上清を取り除き 8 の溶液を添加した。
- 冷蔵で一晩静置した。
- 上清を取り除き、 50 mmol/l トリス緩衝液(pH 7.5)で 3 回洗浄した。
- 上清を取り除き、0.2 mg/ml DAB( 同仁化学研究所、品コード:D006)、0.003% H2O2、50 mmol/l トリス緩衝液 (pH 7.5) を添加した。
- 室温で 10 分間静置した。
- 上清を取り除き、 50 mmol/l トリス緩衝液(pH 7.5)で 3 回洗浄した後、50 mmol/l トリス緩衝液(pH 7.5)を添加した。
- 染色細胞を顕微鏡で観察した。
図 2 HeLa 細胞のミトコンドリアの免疫染色画像
よくある質問/参考文献
LK33: Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit
Revised Nov., 22, 2024