Lysosomal Lipid Radical Probe -Lyso-NBD-Pen-L271 取扱説明書

　フェロトーシスは、鉄イオンに依存した脂質過酸化物の異常な蓄積によって引き起こされる細胞死の一種です。脂質過酸化の進行過程では、脂質の酸化反応に伴い、様々な反応中間体が生成されますが、近年、細胞内におけるフェロトーシスは、リソソームの脂質過酸化によって生成する脂質ラジカルが起点となることが報告されており、リソソームの脂質ラジカルを検出することが重要になってきています¹⁾。
　Lyso‑NBD‑Penは、細胞内リソソームに局在し、リソソームで生成される脂質ラジカルと選択的に反応する蛍光色素です。培養細胞に添加すると、細胞膜を透過してリソソームに集積し、脂質ラジカルとの反応により蛍光シグナルを発するため、細胞内リソソーム脂質ラジカルの検出が可能です。

Lysosomal Lipid Radical Probe -Lyso-NBD-Pen-

2 nmol

 

 冷暗所にて保存してください。

– 蛍光顕微鏡、もしくはフローサイトメーター

– インキュベーター(37℃)　　

– マイクロピペット(100–1000 µl, 20–200 µl, 1–10 µl)

– コニカルチューブ

– 培地またはHBSS (Hanks' balanced salt solution)

・輸送中の振動等により、内容物がマイクロチューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合がありますので、開封

　前に内容物を底面に落としてからご使用ください。

・検出器毎の推奨測定波長は表1を参照してください。

検出器	蛍光顕微鏡	フローサイトメーター
測定波長	・共焦点レーザー顕微鏡 EX/Em: 488/490–600 nm ・落射型顕微鏡 GFPフィルター	FITCフィルター

　　　　　　　　　　表1  検出器別の推奨測定波長

 

100 µmol/l Lyso-NBD-Pen DMSO stock solutionの調製

Lyso-NBD-Pen 2 nmolを含むチューブに20 μlのDMSOを加えピペッティングにより溶解し、100 µmol/l DMSO stock solutionを調製する。

• 調製後は遮光し、-20 °Cで保存して下さい (1ヶ月間安定)。

100 nmol/l Lyso-NBD-Pen working solutionの調製

Lyso-NBD-Penを血清入り培地で1000倍希釈し、100 nmol/l working solutionを調製する。

• working solutionは保存できません。調製したその日の内にご使用ください。
• 容器別のworking solution量は表2を参考にして下さい。

容器	35-mm dish	ibidi 8-well plate	96-well black plate (clear bottom)
必要量	2 ml	200 μl/well	100 μl/well

　　　　　　　　表2  容器別working solutionの推奨使用量  

 

1. 細胞をディッシュに播種し、5% CO₂存在下、37°Cで一晩培養する。
2. 培地を取り除き、培地を用いて1回洗浄する。
3. 上清除去後、表2を参考に、適切な量の100 nmol/l Lyso-NBD-Pen working solutionを添加し、5% CO₂インキュベーター内に37°Cで30分インキュベートとする。
4. Working solutionを吸引除去し、培地で細胞を2回洗浄後する。
5. 薬剤等を含んだ培地で適切な時間処理する。
6. 上清を吸引除去し、HBSSで細胞を2回洗浄する。
7. 各蛍光検出器で検出する。

RSL3処理によりフェロトーシスを誘導したHT-1080細胞の蛍光顕微鏡を使ったリソソーム脂質ラジカル検出

1. ibidi 8-well plateに3×10⁴ cells/wellの濃度でHT-1080細胞 (MEM, 10% fetal bovine serum,1% penicillin-streptomycin)を播種し、インキュベーター内 (37°C、5% CO₂存在下)で一晩培養した。
2. 上清を取り除き血清入り培地で細胞を1回洗浄後、100 nmol/l Lyso-NBD-Pen working solutionを200 µl/well添加し、インキュベーター内 (37°C、 5% CO₂存在下)で30分間インキュベートした。
3. 上清を除去し、血清入り培地を用いて細胞を2回洗浄後、1 µmol/lのRSL3/血清入り培地溶液を加え、インキュベーター内 (37°C、5% CO₂存在下)で2時間インキュベートした。
4. 上清除去後、HBSSで細胞を2回洗浄し、容器をHBSSで満たした。
5. 蛍光顕微鏡で細胞を観察した。

検出器： 共焦点レーザー顕微鏡 Ex/Em: 488/490–600 nm Scalebar: 20 µm

図1　共焦点レーザー顕微鏡におけるHT-1080細胞のリソソーム脂質ラジカルの検出

RSL3処理によりフェロトーシスを誘導したHT-1080細胞のフローサイトメーターを使ったリソソーム脂質ラジカル検出

1. 6-well plateに3×10⁵ cells/wellの濃度でHT-1080細胞 (MEM, 10% fetal bovine serum,1% penicillin-streptomycin)を播種し、インキュベーター内 (37°C、5% CO₂存在下)で一晩培養した。
2. 上清を取り除き血清入り培地で細胞を1回洗浄後、100 nmol/l Lyso-NBD-Pen working solutionを2 ml/well添加し、インキュベーター内 (37°C、 5% CO₂存在下)で30分間インキュベートした。
3. 上清を除去後、血清入り培地を用いて細胞を2回洗浄し、1 µmol/lのRSL3/血清入り培地溶液を加え、インキュベーター内 (37°C、5% CO₂存在下)で2時間インキュベートした。
4. 上清除去後、HBSSで細胞を1回洗浄し、0.25% トリプシン-EDTAを用いて細胞を剥離した。
5. 剥離した細胞を血清入り培地で1.5 mlチューブに回収し、300 x gで5分間遠心した。
6. 上澄みを除去し、PBSを1 ml加え細胞を再懸濁後、300 x g で 5 分間遠心した。
7. 上澄みを除去し、PBSを1 ml加え細胞を再懸濁した。
8. サンプルをフローサイトメーター測定用のセルストレーナーに通しフローサイトメーターにて測定した。

検出器： フローサイトメーター FITCフィルター

図2　フローサイトメーターにおけるHT-1080細胞のリソソーム脂質ラジカルの検出

1) K. Yamada et al., Nature Communications, 2025, 16, 2554.