-Bacstain- CFDA solutionBS03 取扱説明書

-Bacstain- series は細菌用の蛍光染色試薬群です。下図に示す異なる 3 つの手法により菌の生存率を求める事が可能です。CFDA は細胞内エステラーゼ活性により蛍光を発する色素として、菌染色で広く用いられています。CFDA はそれ自体では蛍光を持ちませんが、細胞内でエステラーゼにより分解され蛍光性のカルボキシフルオレセイン（λ_em 515 nm）となります。-Bacstain- CFDA solution は CFDA を DMSO 溶液としていますので、調製の手間無くご使用頂けます。

CFDA DMSO 溶液

375 μl × 4, 10 mg/ml

0-5℃ にて保存して下さい。

• Flow cytometer (488 nm laser, green emission filter)
• 蛍光顕微鏡 (blue exitation filter, green emission filter)
• インキュベーター
• マイクロピペット (20 μl, 1,000 μl)

1. 凍結した CFDA 溶液を融解するため、室温にて 30 分間静置する。この際、遮光を行なうこと。
2. 菌を PBS(-) もしくは生理食塩水 ^a) に懸濁し、細胞密度を調整する。
   10⁶ cells/ml(flow cytometry), 10⁸ -10⁹ cells/ml(microscopy).
3. 細胞懸濁液 1 ml に対し、下表に示された量の CFDA 溶液を加えで混合する。

   	Microscopy	Flow cytometry
   CFDA solution	15 µl	5 µl

4. 37 ℃ にて 5 分間インキュベーションする ^b)。
5. ホルムアルデヒド（終濃度 1-4％）を用いて細胞を固定化する。
6. 遠心もしくは濾過によりバッファーを除去し、新たなバッファーで再懸濁する。
7. フローサイトメーターまたは蛍光顕微鏡で観察する。

a) 下図に示すようにグラム陽性菌に比べグラム陰性菌は CFDA で染色されにくい傾向にあります。細胞外膜の存在により CFDA が細胞内に透過されにくいためです。グラム陰性菌を染色される際は、下に示しております 0.1 mol/l のリン酸バッファーを使用されることを推奨します。

0.1 mol/l-Phosphate buffer (pH8.5, 5%(w/v)-NaCl, 0.5 mmol/l-EDTA disodium salt)

b) CFDA による染色が十分に確認されない場合は、インキュベーション時間を長くしてください。

染色バッファーの違いにより CFDA 染色効率は大きく異なります。

-Bacstain- DAPI solution または-Bacstain- PI solution を用いることにより CFDA との二重染色が可能です。

本マニュアルに準じた場合、約 100 検体分の測定が可能です。

1. N. Yamaguchi and M. Nasu, " Flow cytometric analysis of bacterial respiratory enzymatic activity in the natural aquatic environment ", J. Appl. Microbiol. , 1997, 83 , 43.
2. M. Kawai, N. Yamaguchi and M. Nasu, "Rapid enumeration of physiologically active bacteria in purified water used in the pharmaceutical manufacturing process ", J. Appl. Microbiol. , 1999, 86 , 496.
3. T. Someya et al. , " Fluorescence Direct Count of Bacteria in Various Manures and Composts as Compared with Plate Count(Program for 2005 Annual Meeting of Japanese Society of Soil Science and Plant Nutrition)”, Journal of the science of soil and manure, Japan , 2005, 76 (4), 401.

-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit (for Flow cytometry)
-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit (for Microscopy

CTC は菌の呼吸活性により還元を受け、蛍光性 formazan を生成します。生菌に選択的な蛍光色素として、多く用いられています。
-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit はエンハンサーの効果により、従来の CTC 染色をより迅速・高感度にできるキットです。

Enhancing reagent の添加により CTC 染色能が大きく向上します。

CTC 染色した Candida albicans のフローサイトメトリー解析

 

-Bacstain- DAPI solution, AO solution

DAPI 及び AO は核酸染色試薬として頻用されます。膜損傷の有・無 にかかわらず、細胞内に透過し、核酸を染色します。

 

-Bacstain- PI solution

PI は損傷した膜をもつ細胞にのみ透過し、核酸を染色します。

 

Products	Code	Maximum Ex/Em(nm)	Number of assays
CTC Rapid Staining Kit (for Flow cytometry)	BS01	430, 480/630	100
CTC Rapid Staining Kit (for Microscopy)	BS02	430, 480/630	100
CFDA solution	BS03	493/515	100
DAPI solution	BS04	360/460	100
AO solution	BS05	420-460/630-650(ssDNA)	100
		500/520(dsDNA)
PI solution	BS07	530/620	100

これらは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発製品です。