ヒストン修飾と特異的モノクローナル抗体

木村　宏 　東京工業大学 　科学技術創成研究院 　細胞制御工学研究センター

Abstract
　Eukaryotic nuclear DNA wraps around core histones to form nucleosomes, which are the basic units of chromatin. As core histones tightly bind to DNA, their posttranslational modifications can regulate genome function, including transcription, chromosome replication, repair, and segregation. For epigenetic gene regulation, methylation on lysine residues particularly plays an important role, and the local and global histone modification states can be a good indication of chromatin state for gene expression. Specific modifications fluctuate in response to the cell cycle progression and DNA damages. Among the various methods to detect histone modifications, specific monoclonal antibodies are useful for analyzing the genomic and spatial localizations by chromatin immunoprecipitation and immunofluorescence microscopy. Recent development of live cell imaging techniques has enabled to track the modification dynamics in living cells.

▲ページのトップへ

１．はじめに

　真核生物の細胞核に存在するゲノム DNA は、クロマチンと呼ばれる高次構造体として存在している。クロマチンの基本単位は、 DNA とコアヒストンから構成されるヌクレオソームである（図 1）。ヌクレオソームの構造や性質は、 DNA を鋳型または基質とするすべての反応に大きく影響することから、ヌクレオソームを構成するヒストンの種類や翻訳後修飾は、転写、複製、組換え、修復などの制御機構に重要な役割を果たす。そのため、細胞内でゲノム上のどの領域がどのようなクロマチン構造・ヒストン修飾状態で存在するのかを明らかにすることは、遺伝子発現制御をはじめとしたゲノム機能制御の理解に極めて重要である。本総説では、ヒストン修飾に関する現在の知見を概説するとともに、その検出法について紹介する。

▲ページのトップへ

２．ヒストンとヌクレオソーム

　ヌクレオソームを構成するタンパク質として、4 種類のコアヒストン（H2A、H2B、H3、H4）が知られている（ヒストンには、ヌクレオソームとヌクレオソームをつなぐリンカー DNA に結合するリンカーヒストン H1 も存在する）。これらのコアヒストンは、ヌクレオソームの形成に関与するヒストンフォールドと呼ばれる中央のドメインとヌクレオソームから飛び出した N 末端あるいは C 末端の柔軟なドメインを持つ ^1）。 4 種類のコアヒストンそれぞれが 2 分子ずつのオクタマー（8 量体）を形成し、145 〜 147 塩基対の DNA と共に、ひとつのヌクレオソームが形成される。このヌクレオソームが 50 塩基対程度（10 〜 80 塩基対）のリンカー DNA を挟んで連なり、さらに多くのタンパク質や RNA が結合したものがクロマチンである。
　4 種類のコアヒストンは等価ではなく、 2 つの H3-H4 複合体と DNA によりヌクレオソーム様構造（テトラソーム）が形成されるのに対して、H2A-H2B と DNA のみではヌクレオソーム様構造はできない。実際、新規にヌクレオソームが形成される際には、 H3-H4 と DNA により形成されたテトラソームに、2 つの H2A-H2B 複合体が結合することで、ヌクレオソームが完成する ^2）。完成したヌクレオソームは、試験管内では非常に安定に存在するが、細胞内ではダイナミックに変化しうる。ヌクレオソームを鋳型として転写や複製が起こる際には、 H2A-H2B が解離するのに対して、多くの H3-H4 は DNA から解離せずに維持される ^3）。また、比較的ゆっくりとした速度（半減期約 2 時間）ではあるが、 H2A-H2B の交換が起こる ^4）。そのため、 H2A や H2B の修飾よりも H3 や H4 の修飾が、より長期にわたるゲノム機能制御に働くと考えられる。

▲ページのトップへ

３．ヒストン修飾

　すべてのコアヒストンは、翻訳後修飾を受けることが知られている。特に、ヒストン H3 のリジン残基の ε - アミノ基のアセチル化（ac）、メチル化（me）、ユビキチン化（ub）は、遺伝子発現の制御において主要な役割を果たしている。単一のアミノ基に対して、アセチル基とユビキチンはひとつしか付加されないが、メチル基は 3 つの水素と置換しうるため、メチル化は 3 つの状態（モノメチル化, me1；ジメチル化, me2；トリメチル化, me3）をとりうる。また、それぞれのヒストンには多数のリジン残基が存在するが、同じ修飾であっても、どのリジン残基上に起こるのかによって、意義が異なる（図 1）。

修飾されたヒストンは、その種類、アミノ酸番号、修飾の略称で表記されることが多く、例えばヒストン H3 の 9 番目のリジン残基のトリメチル化は、H3K9me3 と表記される。ヒストン H3 のリジン残基のメチル化（H3K9me3 や H3K27me3）は、 DNA メチル化と共に細胞分裂や世代を経ても維持され、遺伝子の発現状態の世代を超えた制御に関与する。この DNA 塩基配列の変化を伴わずに起こる遺伝子発現抑制などの継承はエピジェネティクス（後成的遺伝学あるいは後生的遺伝学）と呼ばれている。

▲ページのトップへ

４．ヒストン修飾と遺伝子発現制御

　一般に、発現している遺伝子では、その転写開始点付近に H3K4me3 と H3K27Ac が、エンハンサー領域に H3K4me1 と H3K27Ac が濃縮されている ^5）（図 1）。また、遺伝子領域の特にエキソン上では H3K36me3 が見られる。それに対して、転写が抑制されたゲノム領域では、H3K9me3 や H3K27me3 が構成的ヘテロクロマチンや条件的ヘテロクロマチンに局在する。構成的ヘテロクロマチンは、トランスポゾンやレトロウィルスに由来する繰返し配列など発生や分化を通してほとんどの細胞で抑制されているクロマチンであり、セントロメア近傍の繰返し配列（ヒトでは α サテライト、マウスではメジャーサテライト）などに代表される。条件的ヘテロクロマチンは、特定の細胞種で抑制されたクロマチンであり、未分化細胞では見られず細胞分化に伴って形成される不活性 X 染色体などに代表される。現在、ヒトの正常組織の標準エピゲノム情報を取得するための国際組織 IHEC（ヒトエピゲノムコンソーシアム；international human epigenome consortium）により、上記 6 つのヒストン修飾（H3K4me1、H3K4me3、H3K9me3、H3K27Ac、H3K27me3、H3K36me3）と DNA メチル化の解析が進められている ^6）。これらの標準エピゲノムは、組織や細胞の遺伝子発現制御機構の理解に加え、疾患エピゲノムとの比較に有用であると考えられる。

▲ページのトップへ

５．ヒストン修飾と細胞周期

　新規に合成されたヒストン H3 と H4 は、ヒストンシャペロン複合体と結合し、ヌクレオソーム形成に働くが、ヒストンシャペロン複合体中には、ヒストンアセチル化酵素（HAT1； histone acetyltransferase 1）が含まれており、ヒストン H4 の K5 と K12 がアセチル化される ^2）。そのため、新規に形成されたヌクレオソームは、H4K5acK12ac（ジアセチル化）状態にある ^7）。一方、ヌクレオソームに取り込まれた直後の H4K20 はメチル化されていないが、G2 期から M 期にかけて、H4K20 モノメチル化酵素（PR-Set7）により H4K20me1 レベルが大きく上昇する ^8,9）。PR-Set7 のノックダウンにより細胞分裂の進行が異常になることなどから、H4K20me1 は正常な染色体凝縮や分配に必要であることが示唆されている ^8）。また、細胞周期の M 期では、大部分の H3 の S10 や S28 がリン酸化される ^10,11）。さらに、細胞死（アポトーシス）の過程では、H2B の S14 のリン酸化が起こる ^12）。したがって、これらの修飾を検出することで、細胞周期やアポトーシスの解析が可能になる。

▲ページのトップへ

６．ヒストン修飾と DNA 損傷修復

　DNA 損傷修復過程においても、ヒストン修飾のダイナミックな変化が起こる。特に、電離放射線（γ 線）による DNA の二重鎖切断に対する応答として、H2A のバリアントである H2A.X の S139 がリン酸化されることが見出され、このリン酸化 H2A.X は γH2A.X と呼ばれている ^13）。1 箇所の二重鎖切断に対しその周辺 Mb 単位に渡ってリン酸化が起こるため、H2A.X は、 DNA 修復因子の損傷部位への効率的な集積に働くと考えられているほか、高感度な二重鎖切断のマーカーとしても用いられている ^14）。H2A.X は、リン酸化と独立した経路によって、アセチル化やユビキチン化も受けることが知られており、これらの修飾と DNA 損傷修復のメカニズムの解明が進められている ^15）。また、紫外線による DNA 損傷修復過程においては、H3K27Ac のレベルが損傷部位で低下することも示されている ^16）。

▲ページのトップへ

７．エピゲノム修飾と疾患

　最近、加齢や様々な疾患とエピゲノム変化との関係が注目されているが、その中でも、特にがんとエピジェネティクスの関係についての解析が特に進んでいる ^17）。多くのがん細胞では、がん抑制遺伝子の発現が抑制されており、それら遺伝子の転写制御領域では DNA メチル化や転写抑制に働くヒストン H3 メチル修飾が多く見られる。また、多くのがん細胞において、エピゲノム修飾を介した遺伝子発現制御に働くタンパク質の変異や転座、発現レベルの異常が高頻度で見つかっている ^18）。これらの異常により、特定領域のエピゲノム修飾の変化のみならず、ヒストン修飾のグローバルなレベルの変動も見出されている。例えば、 H4K16ac と H4K20me3 のレベルががん細胞で低下していることや、 H3K18ac と H3K4me2 のレベルが低いほど前立腺がんの再発や、肺がんと腎臓がん患者の生存率と関係することが示されている ^19）。また、神経膠腫ではヒストン遺伝子そのものの変異も比較的高頻度で検出されており、 H3.3 の K27 の Met への変異により、 K27 のメチル化レベルが全体的に低下することも知られている ^20）。これらの変異や修飾状態の変化とがん化のメカニズムとの関係は不明な点が多いが、ヒストン修飾の検出が診断や創薬に応用できることは重要である。

▲ページのトップへ

８．ヒストン修飾の検出法

　ヒストン修飾は、様々な方法により検出されている。その化学的特性を検出する方法として、古典的には Acid-Urea-Triton（AUT）ゲル電気泳動が用いられてきた。 AUT ゲル電気泳動では、ヒストンの電荷に影響を与えるリジン残基のアセチル化やセリン・スレオニン残基のリン酸化などを移動度から判別できる。実際、 γH2AX やアポトーシスに伴う H2BS14ph は AUT ゲル電気泳動により発見された ^{12, 13）}。 AUT ゲル電気泳動により、ヒストンバリアント（例えば、H3.1、H3.2、H3.3）の分離も可能である。近年、質量分析による解析手法が発展し、高感度で定量的に多様な修飾の検出が可能になっている ^21）。また、安定同位体を用いたパルス-チェイス法により、ヒストン修飾のターンオーバー速度の検出も可能になり、修飾のダイナミクスの理解も進んでいる ^22）。質量分析を用いたヒストン修飾の解析法は極めて有用であるが、個々の細胞レベルや特定のゲノム領域での解析には向いていない。それに対して、抗体を用いた方法では、多数の修飾の同時検出という点でのスループットは低いが、単一細胞の解析や特定のゲノム領域の解析が可能である ^5）。

▲ページのトップへ

９．ヒストン修飾特異的モノクローナル抗体

　様々なヒストン修飾に対する抗体は、ウェスタンブロッティング、クロマチン免疫沈降（ChIP；chromatin immunoprecipitation）、免疫染色など様々な解析に用いることができる（図 2）。

現在、ウサギやマウス由来の修飾ヒストン特異的抗体が多く市販されているが、その使用に際しては目的の修飾に対する特異性が検証されている必要がある。リジンのメチル化はその部位とレベルに応じて遺伝子発現調節における役割が異なるため、それらを明確に区別できる特異性が求められる。例えば、H3K9me3 に対する特異的抗体であるならば、H3K9me1 や H3K9me2 に加えて H3K27me3 に対する交差性が少ないことが必須である。また、近傍のアミノ酸の修飾の有無が抗体の反応性に与えることもあるため、修飾の組み合わせに対する反応性が調べられていることが望ましい ^{10, 23）}。ポリクローナル抗体の場合、同一の修飾ペプチドを抗原とした場合でも別の動物個体において得られた抗体の特性は異なるため、ロット毎のチェックが必要である。我々は、将来にわたって再現性の良い解析を可能にするために、野崎直仁博士（株式会社モノクローナル抗体研究所）と共同で特異性の高いモノクローナル抗体を開発してきた ^{7, 10, 11, 23-32）}。モノクローナル抗体の場合は、樹立された抗体産生ハイブリドーマ細胞から調製するため基本的にロット間での抗体の特性に差が無く、実験の再現性が保障される。現在までに、ヒストン H3 と H4 の多くのリジン残基のアセチル化とメチル化、セリン残基とスレオニン残基のリン酸化に特異的な抗体が得られている ^{7, 10, 11, 23 - 30）}（表 1）。また、転写を担う酵素である RNA ポリメラーゼのリン酸化とメチル化に特異的な抗体も開発した ^{31, 32）} （表 2）。これらのモノクローナル抗体は、ウェスタンブロッティング、 ChIP、免疫染色など、多くの用途に使用可能である。また、免疫染色の場合、異なる蛍光色素で直接標識することで、複数の修飾の局在とレベルを同時に評価することができる。

▲ページのトップへ

10．抗体由来の生細胞プローブ

　最近、ヒストン修飾特異的モノクローナル抗体由来のプローブを用いることで、生きた細胞内でヒストン修飾を可視化・計測することが可能になってきた ^33）。この目的には、蛍光標識した抗原結合断片（Fab; antigen binding fragment）や蛍光タンパク質と融合した一本鎖可変領域抗体（scFv; single-chain variable fragment）が用いられる（図 2）。これらの抗体由来の蛍光プローブは、細胞内でも標的のヒストン修飾に特異的に結合するため、ヒストン修飾の局在や相対的な修飾レベルを検出することができる。細胞内でのプローブとヒストン修飾との結合時間は 1 秒以下から数秒程度であり、内在性のタンパク質の結合にあまり影響せず、プローブが存在しても細胞の増殖や胚の発生は正常に進行する ^27）。それは、抗原との結合部位が 1 箇所である Fab や scFv では、 IgG に比べて抗原との結合の親和性が 100 〜 1000 倍程度低下するのに加え、細胞内ではタンパク質濃度が数百 mg/ml と非常に高く分子の衝突頻度も高くなるためであると考えられる。 Fab を用いた方法（FabLEM; Fab-based live endogenous modification）により、マウス受精卵のヒストンアセチル化動態 ^27）や動物培養細胞でのホルモン刺激による転写活性化におけるヒストンアセチル化の機能 ^31）が解明された。また、Mintbody（modification-specific intracellular antibody）と名づけた遺伝子コード型のプローブ（蛍光タンパク質と融合した修飾特異的 scFv）は、細胞や生体内で安定に発現させることができるため、長時間にわたるイメージングや動植物個体の生体イメージングが可能になっている ^{9, 34）}。

▲ページのトップへ

11．おわりに

　ヒストン修飾と遺伝子発現制御との関係は近年大きく理解が進み、特定のヒストン修飾の転写開始点やエンハンサーへの集積が遺伝子発現の指標となることが確立されてきた。しかし、これらの修飾が実際にどのように転写を活性化するのか、あるいは、転写が起きた結果として付加されるのか、等についてのダイナミクスに関する理解はあまり進んでいない。実際、 H3K4me3 が転写開始領域にあるからといって、その遺伝子は常に転写されているとは限らない。今後、生細胞解析などを通して、ヒストン修飾をはじめとした細胞核・クロマチン構造による転写制御機構の実体が解明できると期待される。一方、モノクローナル抗体を用いた簡便な解析系は、ヒストン修飾を指標とした病態の評価や創薬に関する研究開発にとって、今後も益々有用になってくると考えられる。