膜透過性ポリジスルフィド（CPDs）を用いた細胞内導入

　ドラッグデリバリーシステム（DDS）において、効率的な細胞内への薬物導入は大きな課題の一つである ^1）。
　この課題に対して、HIV ウイルス由来の TAT ペプチドの有用性が見出されて以来、アルギニンに富んだペプチドを利用した薬物等の細胞内導入が活発に研究され、DDS への応用が期待されている。このようなアルギニンペプチドを利用した細胞内への取り込みはマクロピノサイトーシスと呼ばれる特殊なエンドサイトーシスが関与しており、導入したい化合物をアルギニンペプチドと結合させることによって、比較的容易に細胞内に取り込ませることが可能である ^2）。しかしながら、アルギニンペプチドは、細胞毒性があること、また、エンドソームに捕捉されるために効率的な細胞内導入が行えない、などの課題が残されている。
　本稿では、これらの課題を克服した新しい細胞内導入法について紹介したい。
　最近、細胞毒性が少ないキャリアとして、細胞膜透過性ポリジスルフィド（CPDs）を用いた細胞内導入が注目されている。これらは、ジスルフィド結合を介してアルギニンペプチドのような細胞膜透過性部位をポリマー化したものであり、細胞内に導入されるとグルタチオンなどの還元物質によって還元され、目的物質が放出されるというものである。このようなメカニズムを利用することで、低毒性で効率的な細胞質への輸送を可能にしている。一般的に CPDs は、ポリエチレンイミン（PEI）のようなポリマーにジスルフィドを有する分子を化学修飾することや、ジスルフィドを有するモノマーを用いて共有結合的にポリマー化することによって作製する。しかし、このような手法では主に遺伝子導入のような非共有結合的な細胞内導入にしか適用できなかった。そこで、Matile らは、開環ジスルフィド交換反応を用いた新しい CPDs 作製法を提案している ^3）。本手法を用いた場合、ポリマー化は基質のチオール基がトリガーとなって進行する。基質のチオール基が、アルギニン側鎖を導入した環状 S-S 結合をもつモノマーと反応すると、ジスルフィド結合が開裂し、新しいチオール基が生成される。このチオール基が別の環状 S-S 結合をもつモノマーと反応すると、また新しいチオール基が生成される。この反応が連続して起こることで、ポリマー化が進行し、ヨードアセトアミドを加えることによって停止する（Fig. 1）。

　Matile らは、これらの手法で作製した CPDs の細胞内導入の様子を、基質として蛍光物質であるカルボキシフルオレセイン（CF）チオール基誘導体を用い、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（CLMS）で観察している ^4）。
　その結果、比較的脂溶性の低いリポ酸ベースの側鎖を持つポリマー 4 が効率的に細胞質に導入され、脂溶性の高いポリマー 2 はエンドソーム内に、そしてメチルエステルを有するポリマー 1 は核に集積することが確認されている。

　このような側鎖の構造によるポリマーの細胞内局在の違いは、脂溶性と S-S 交換反応の速度が関係していると考えられる。脂溶性が高いポリマー 2 はエンドサイトーシスを介して細胞内に導入され、エンドソームに捕捉されやすい。一方、脂溶性の低いポリマー 1,4 は、エンドサイトーシスを介さず、細胞膜表面のチオール基と CPDs が共有結合することによって、細胞膜を通過し、細胞内のグルタチオンにより細胞内に放出されると推察されている。また、細胞質に局在化するポリマー 4 は S-S 交換反応の速度が速く、核に局在化するポリマー 1 は交換反応が遅い。つまり、ポリマー 4 は細胞内に導入された後、即座にグルタチオンと反応して細胞質内で基質が放出されるのに対し、ポリマー 1 はその反応速度が遅いため細胞質で放出されず核まで移行する、とされている。さらに、ポリマー 4 の細胞毒性は非常に低く、ポリアルギニンでは明らかな細胞毒性を示す 10 μM でもほとんど細胞毒性を示していない。このような細胞毒性の低さは、その特有の細胞内導入機構によるものと考えらえる（Fig. 3）。
　以上のように、今回紹介した CPDs は低毒性で、かつ効率的な細胞内導入を可能にする。また、チオール基を有する化合物であれば、容易にポリマーに挿入することができ、導入効率は付加した化合物には依存しない。今後、S-S 交換反応の速度制御や細胞内導入の詳細なメカニズム解明等の問題点を解決していくことで、ドラッグデリバリーシステムの発展にも大きく貢献する可能性があると考えられる。

▲ページのトップへ

参考文献

1） A. G. Torres and M. J. Gait, Trends Biotechnol., 2012, 30, 185-190.

2） M. Kosuge, T. Takeuchi, I. Nakase, A. Tomos Jones and S. Futaki, Bioconjugate Chem., 2008, 19, 656-664.

3） E. Bang, G. Gasparini, G. Molinard, A. Roux, N. Sakai and Stefan Matile, J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 2088-2091.

4） G. Gasparini, E. Bang, G. Molinard, D. V. Tulumello, S. Ward, S. O. Kelley, A. Roux, N. Sakai and S. Matile, J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 6069-6074.