細胞を3次元的に約４倍に拡大

HeLa細胞の核をDAPIで染色し、本キットを用いて膨張顕微鏡法による観察を行いました。
ゲルの大きさと染色した核を膨張の指標として膨張倍率を確認した結果、XYZ軸それぞれに約4倍膨張することを確認しました。

＜ゲルの大きさ＞
      
 

＜核染色＞

＜検出条件＞
検出装置: 共焦点レーザー顕微鏡 Lens 40× Water objective
DAPI(青): Ex/Em = 405/420-480 nm

膨張前: Laser 1.0%, Gain 550 V 
膨張後: Laser 2.5%, Gain 680 V

膨張前後の細胞の解像度・サイズ変化の評価

RPE1細胞の核をDAPIで染色後、本キットを用いて細胞を膨張させ、20倍水浸レンズを使用した共焦点顕微鏡で観察しました。
同一細胞において、膨張前（Pre-3D-ExM）と膨張後（Post-3D-ExM）を比較した結果、膨張後の細胞は解像度が向上し、さらに長軸・短軸の長さおよび面積が約4倍に増大していることを確認しました。

※青枠(1)上段、赤枠(2)下段は、膨張前後の同一細胞における２つの細胞領域の解像度の変化の例を示しています。

＜実験条件＞
細胞：RPE1 (hTERT-immortalized retinal pigment epithelial cells)
染色: DAPI 30 min

＜観察条件＞
​顕微鏡システム：スピニングディスクコンフォーカル(Yokogawa CSU + Nikon Ti2 stand+ CMOSカメラ)
Imaging conditions: A 20× water-immersion objective was used for both pre- and post-ExM imaging (the same cell was imaged with identical optical settings).
405 laser: 60% power with 200 msec exposure for ExM

データ提供：Dr. Aussie Suzuki at the University of Wisconsin–Madison

膨張後の核とチューブリンの観察

RPE1細胞の核およびチューブリンを染色した後、本キットを用いて細胞を膨張させました。その後、20倍水浸レンズを用いて共焦点顕微鏡にて観察し、さらに同一の細胞を60倍油浸レンズでも観察しました。その結果、核および細胞骨格の詳細な形態を確認できました。

＜実験条件＞
細胞: RPE1 (hTERT-immortalized retinal pigment epithelial cells)
染色:　
　一次抗体  anti-alpha-Tubulin (DM1A), 1 hour
　ニ次抗体  Alexa488 conjugated anti-mouse-IgG, 1 hour
　DAPI, 30 min

＜観察条件＞
​顕微鏡システム：スピニングディスクコンフォーカル(Yokogawa CSU + Nikon Ti2 stand+ CMOSカメラ)
Imaging conditions: A 20× water-immersion objective was used for both pre- and post-ExM imaging (the same cell was imaged with identical optical settings). The same cell was also imaged using a 60× oil-immersion objective to obtain higher-resolution images.
405 laser: 60% power with 200 msec exposure for ExM
​488 laser: 60% power with 200 msec exposure for ExM

データ提供：Dr. Aussie Suzuki at the University of Wisconsin–Madison

実験例：薬剤処理毎のミトコンドリア形態変化の観察

脱分極剤であるCCCP、複合体III阻害剤であるアンチマイシンおよび、ATP合成酵素阻害剤であるオリゴマイシンで処理したHeLa細胞のミトコンドリアの外膜(TOM20）、および内膜(COX IV)を染色し、本キットを用いて膨張顕微鏡法により観察しました。
その結果、膨張前の細胞では、ミトコンドリアの分裂は確認できるものの外膜と内膜の判別が困難でした。一方で、膨張後の細胞では、ミトコンドリア膜電位を脱分極させるCCCPおよびアンチマイシン処理では、外膜がリング状（ミトコンドリア分裂）を示し、内部に内膜タンパク質COX IVが存在しない構造(黄色矢印)が観察されました。さらに膜電位を脱分極させないオリゴマイシン処理では、分裂したミトコンドリア内部にCOX IVが観察されました。本キットを用いることで、ミトコンドリア分裂時の内膜の変化まで観察することができました。

＜実験条件＞
CCCP : 10 μmol/l 30 min処理
Antimycin: 10 μmol/l 30 min処理
Oligomycin: 10 μmol/l 30 min処理

＜検出条件＞
検出装置：共焦点レーザー顕微鏡 (Zeiss LSM800)
TOM20 (緑）: Ex/Em = 488/500-550 nm
COX IV (赤): Ex/Em = 561/580-620 nm

膨張前
Lens: 63× Oil objective
TOM20: Laser 1.0 %, Gain 650 V
COX IV: Laser 2.0 %, Gain 650 V
膨張後
Lens: 63× Oil objective
TOM20: Laser 70 %, Gain 700 V
COX IV: Laser 70 %, Gain 750 V