02 酸化ストレス関連試薬

-SulfoBiotics- Protein S-Nitrosylation Monitoring Kit

-<i>SulfoBiotics</i>- Protein <i>S</i>-Nitrosylation Monitoring Kit

生体硫黄解析用キット

  • 製品コード
    SB14  -SulfoBiotics- Protein S-Nitrosylation Monitoring Kit
容 量 本体価格
20 samples ¥59,000
キット内容
20 samples ・Protein-SHifter Plus
・Reaction Buffer A
・Reaction Buffer B
・Lysis Buffer
・Blocking Stock Solution
・Reducing Agent
x 20
x 1
x 1
x 1
x 1
x 5

性質

タンパク質のチオール基修飾は、代表的な翻訳後修飾の一つであり、生体内のレドックス変化に応答して生じる。
タンパク質S- ニトロシル化反応は、一酸化窒素(NO)によって起こる重要な翻訳後修飾であり、転写やタンパク質発現、シグナル伝達などの様々な細胞機能の制御に関与していることが明らかにされている。
 -SulfoBiotics- Protein S-Nitrosylation Monitoring Kit は、タンパク質内のS-ニトロシル基をゲル電気泳動法によって解析するためのキットである。
本キットには、タンパク質内遊離チオール基のブロッキング剤、S-ニトロシル基の選択的還元剤およびS-ニトロシル基還元後のチオール基のラベル化剤が含まれている。
タンパク質内の遊離チオール基をブロックした後、S-ニトロシル基をキット付属の還元剤によって選択的に還元する。その後、新規の高分子マレイミド試薬Protein-SHifter Plusによってタンパク質をラベル化し、ゲル電気泳動法によって解析する。ラベル化されたタンパク質は、Protein-SHifter Plus 1 分子あたり分子質量が約15 kDa 増加したバンドとして分離・検出されるため、S-ニトロシル基の数に応じたバンドシフトが得られる。また、Protein-SHifter Plusは光分解能を有するため、電気泳動後のゲルにUV光を照射することによってラベル化されたタンパク質から切り離される。そのため、ラベル化する前と同様に目的タンパク質をウェスタンブロットで検出することが可能である。

開発元 Dojindo Molecular Technologies, Inc

技術情報

図1 本キットを用いたタンパク質内S-ニトロシル基の検出原理


図2 HeLa細胞溶解液中のGAPDH S-ニトロシル化の解析

参考文献

参考文献を表示する

1) S. Hara, Y. Tatenaka, Y. Ohuchi and T. Hisabori, "Direct determination of the redox status of cysteine residues in proteins in vivo", Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015456(1) 339.
2) X. Wang, N. Kettenhofen, S. Shiva, N. Hogg, and M. Gladwin, "Copper dependence of the biotin switch assay : modified assay for measuring cellular and blood nitrosated proteins", Free Radic. Biol. Med.200844, 1362.
3) M. T. Forrester, M. W. Foster, M. Benhar, and J. S. Stamler, "Detection of Protein S-Nitrosylation with the Biotin Switch Technique", Free Radic. Biol. Med.200946(2), 119.
4) M. D. Kornberg, N. Sen, M. R. Hara, K. R. Juluri, J. V. K. Nguyen, A. M. Snowman, L. Law, L. D. Hester, and S. H. Snyder, "GAPDH Mediates Nitrosylation of Nuclear Proteins", Nat. Cell Biol.201012(11), 1094.

よくある質問

Q

ラベル化から電気泳動の工程は遮光して行う必要がありますか?

A

 Protein-SHifter Plusは、アルミラミジップから取り出した後、蛍光灯下で数時間は安定なため、遮光の必要はありません。しかし、ラベル化~電気泳動中は直射日光等の強い光は避けてください。なお、未使用分はアルミラミジップに戻して、口をしっかり閉じて冷蔵保存してください。

Q

S-ニトロシル化する試薬はありますか?

A

タンパク質のS-ニトロシル化には一般的なNOドナー類が使用できますが、特にS-NitrogluathioneやS-Nitrosocysteineなどのニトロソチオール類が有効です。
生細胞に添加する場合には、細胞透過性の高いS-Nitrosocysteineが汎用的に使用されています。

Q

光切断に使用可能な機器情報を教えてください。

A

弊社で光切断実績のある機器は下記の2種類です。実際の光切断は画像を参考ください。
トランスイルミネーター :(メーカー:UVP、型番:NTM-15、切断条件:302nm 15Wで10分)
ハンディUVランプ   :(メーカー:アズワン、型番:SLUV-4、切断条件:365nm 4Wで30分)
また、254nmの光照射(ハンディUVランプまたはクリーンベンチの殺菌灯など)では、十分な光切断ができません。

例) 光切断時のゲルの置き方
 * ゲルが作業中に乾燥しないようガラス板に挟んだ状態で光切断を行ってください。
 * 光源と直接接触させて切断操作を行ってください。


UVトランスイルミネーター


ハンディUVランプ

 

Q

測定に影響を及ぼす物質はありますか?

A

①キレート試薬類: S-ニトロシル基の還元反応に影響を及ぼしますので使用しないで下さい。
 例)EDTA、Neocuproineなど

②還元物質: タンパク質のチオール基の状態に影響を及ぼしますので使用しないで下さい。
 例)DTT、メルカプトエタノール、TCEPなど

取扱条件

取扱条件
1.危険物第4類 第3石油類 危険等級Ⅲ, 2.火気厳禁 3.保存方法:冷蔵, 4.吸湿注意
PRTR法 第1種指定化学物質
危険・有害
シンボルマーク
どくろ健康有害性環境

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