08 ラベル化剤

Biotin Labeling Kit - NH2

Biotin Labeling Kit - NH<sub>2</sub>

抗体・タンパク質標識キット

  • 初めてビオチン標識をする
  • 感度をあげたい
  • 蛍光色素でうまくいかなかった
  • 製品コード
    LK03  Biotin Labeling Kit - NH2
容 量 本体価格
3 samples ¥13,200
サンプル量 50-200 µg
所要時間 2時間
標識部位 -NH2
検出方法 顕微鏡・FCM・ウエスタンブロット・プレートリーダー

・NH2-Reactive Biotinと標的タンパク質を混合するだけで、安定な共有結合を形成する。

・Filtraiton Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。

・キット付属の保存溶液でビオチン標識体の保存ができる。

キット内容
3 samples ・NH2-Reactive Biotin
・WS Buffer
・Reaction Buffer
・Filtration Tube
3 tubes
4 ml x1
500 μl x1
3 tubes

性質

Biotin Labeling Kit - NH2は、アミノ基を有するタンパク質、特に抗体へビオチンを標識するためのキットである。キット付属のNH2-Reactive Biotinは、その分子内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する分子と混合するだけで安定な共有結合を形成する。イムノグロブリンG(IgG)のようなタンパク質にビオチンを標識する場合、標識反応を阻害するような低分子化合物(トリスなど)や未反応のNH2-Reactive Biotinは付属のFiltration Tubeを用いて容易に除去されるため、透析やゲルろ過などの処理を行う必要がなく、高純度の標識体を高い回収率で得ることができる。

開発元 Dojindo Molecular Technologies, Inc.

技術情報

特徴

1) 約2時間でビオチン標識体が調製できる。
2) NH2-Reactive Biotinと標的タンパク質を混合するだけで、安定な共有結合を形成する。
3) 分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。
4) 50~200 μgのタンパク質を標識可能である。
5) Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。
6) キット付属の保存溶液でビオチン標識体の保存ができる。

注意事項

市販の抗体などでゼラチンやアルブミン等を安定化剤として含む場合、それらの成分を除いてからご使用ください。試料中の共存物質の影響については「よくある質問:サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか?」に詳細を記載しておりますのでご参照ください。なお、小社では抗体を簡便に精製できる下記のキットをご用意しております。

 

IgG Purification Kit – A   IgG Purification Kit – G

NH2-Reactive Biotinは、アルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のNH2-Reactive Biotinは、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。NH2-Reactive Biotin以外は、0~5℃で保存してください。

冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。

 

キット以外に必要なもの

・10 μl, 200 μl マイクロピペッター
・インキュベーター(37℃)
・マイクロチューブ(標識体保存用)
・遠心機(マイクロチューブ用)
・DMSO

反応原理

操作方法

実験例1

抗原を未標識抗X抗体でブロックした(A)では、抗体の競合阻害によりビオチン化抗X抗体の反応は見られず、ビオチン化抗X抗体のみを反応させた(B)において陽性分画が見られた。
自製の標識抗体においても非特異的反応の少ない十分な検出反応を行うことが可能である。

(A)未標識抗X抗体を反応後、ビオチン化抗X抗体を反応 (B)ビオチン化抗X抗体のみ反応

(データ提供:北海道大学 遺伝子病制御研究所 黒滝大翼先生、今重之先生)

実験例2

Biotin Labeling Kit - NH2および他社品キットを用いて作成したビオチン標識 Anti-CAT'Chloramphenicol Acetyltrandeferase)抗体を用いたELISA

実験例3

抗CD44抗体をAb-10 Rapid Biotin Labeling Kitを用いてビオチン化後、Biotin標識抗CD44抗体及びFluorescein標識ストレプトアビジンでHL60細胞を免疫染色した。

Biotin Labeling Kit-NH2 を用いて標識した抗体によるフローサイトメトリー測定

 

励起波長:488 nm

蛍光波長:515-545 nm

 

実験例4

ビオチン標識Anti-Nitroguanoisine monoclonal抗体を用いて染色した肺高血圧剤(モノクロタリン)投与ラット肺動脈凍結切片の組織免疫染色像(x200, HRP標識ストレプトアビジン/DAB染色)。


(画像提供:北里大学医療衛生学部微生物学教室 北里英郎先生)

参考文献

参考文献を表示する

         
No. 標識対象 ストレプトアビジン  検出装置    引用(リンク)
1 抗体 POD標識ストレプトアビジン プレートリーダー M. Takahashi, Y. Ishida, D. Iwaki, K. Kanno, T. Suzuki, Y. Endo, Y. Homma and T.  Fujita, "Essential role of Mannose-binding lectin-associated serine protease-1 in activation of the complement factor D"J. Exp. Med.., 2010, 207, (1), 29.
2 ポリクローナル抗体
(anti-human EBI3)
POD標識ストレプトアビジン プレートリーダー R. Nishino, A. Takano, H. Oshita, N. Ishikawa, H. Akiyama, H. Ito, H. Nakayama, Y. Miyagi, E. Tsuchiya, N. Kohno, Y. Nakamura and Y. Daigo, "Identification of Epstein-Barr virus–induced gene 3 as a novel serum and tissue biomarker and a therapeutic target for lung cancer"Clin. Cancer Res.., 2011, 17, (19), 6272.
3 マウスモノクローナル抗体
(MAb 2F4)
POD標識ストレプトアビジン プレートリーダー M. Tahara, S. Ohno, K. Sakai, Y. Ito, H. Fukuhara, K. Komase, M.A. Brindley, P.A. Rota, R.K. Plemper, K. Maenaka and M. Takeda, "The receptor-binding site of the measles virus hemagglutinin protein itself constitutes a conserved neutralizing epitope"J. Virol.., 2013, 87, (6), 3583.
4 抗体
(Anti-Nectin-2 mAbs)
-   T. Oshima, S. Sato, J. Kato, Y. Ito, T. Watanabe, I. Tsuji, A. Hori, T. Kurokawa and T. Kokubo, "Nectin-2 is a potential target for antibody therapy of breast and ovarian cancers"Mol. Cancer., 2013, 12, (60), .
5 マウスIgG抗体(MMG-49) POD/R-PE標識ストレプトアビジン ウエスタンブロッティング,
フローサイトメーター
D. Men, T.T. Zhang, L.W. Hou, J. Zhou, Z.P. Zhang, Y.Y. Shi, J.L. Zhang, Z.Q. Cui, J.Y. Deng, D.B. Wang and X.E. Zhang, "Self-Assembly of Ferritin Nanoparticles into an Enzyme Nanocomposite with Tunable Size for Ultrasensitive Immunoassay"ACS Nano., 2015, 9, (11), 10852.
6 IgM抗体
(TR1)
POD/R-PE標識ストレプトアビジン ウエスタンブロッティング,
フローサイトメーター
X. Piao, T. Ozawa, H. Hamana, K. Shitaoka, A. Jin, H. Kishi and A. Muraguchi, "TRAIL-receptor 1 IgM antibodies strongly induce apoptosis in human cancer cells in vitro and in vivo"Oncoimmunology., 2016, 5, (5), e1131380.
7  マウスモノクローナル抗体 (16A11) POD標識ストレプトアビジン プレートリーダー N. Hosen, Y. Matsunaga, K. Hasegawa, H. Matsuno, Y. Nakamura, M. Makita, K. Watanabe, M. Yoshida, K. Satoh, S. Morimoto, F. Fujiki, H. Nakajima, J. Nakata, S. Nishida, A. Tsuboi, Y. Oka, M. Manabe, H. Ichihara, Y. Aoyama, A. Mugitani , T. Nakao, M. Hino, R. Uchibori, K. Ozawa, Y. Baba, S. Terakura, N. Wada, E. Morii, J. Nishimura, K. Takeda, Y. Oji, H. Sugiyama, J. Takagi and A. Kumanogoh, "The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy"Nat. Med.., 2017, 23, (12), 1436.
8 レクチン
(Recombinant BC2LCN )
Alexa FluorTM 555標識ストレプトアビジン  蛍光顕微鏡   D. Sugahara, Y. Kobayashi, Y. Akimoto, H. Kawakami, "Mouse intestinal niche cells express a distinct α1,2-fucosylated glycan recognized by a lectin from Burkholderia cenocepacia"Glycobiology., 2017, 27, (3), 246.
9 モノクローナル抗体
(H1 HA)
- -  T. Hiono, A. Matsuda, T. Wagatsuma, M. Okamatsu, Y. Sakoda and A. Kuno, "Lectin microarray analyses reveal host cell-specific glycan profiles of the hemagglutinins of influenza A viruses"Virology., 2019, 527, 132.
10 抗体
(lysozyme sdAb, Y52A mutant)
- プレートリーダー T. Kaya, S. Nagatoishi, K. Nagae, Y. Nakamura and K. Tsumoto, "Highly sensitive biomolecular interaction detection method using optical bound/free separation with grating-coupled surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (GC-SPFS)."PLoS ONE, 2019, 14, (8), DOI:10.1371/journal.pone.0220578.
11 タンパク質(recombinant human IL-12P40) - プレートリーダー Y. Morita, T. Imai, S. Bamba, K. Takahashi, O. Inatomi, T. Miyazaki, K. Watanabe, S. Nakamura, A. Yoshida, Y. Endo, N. Ohmiya, T. Tsujikawa and A. Andoh, "Clinical relevance of innovative immunoassays for serum ustekinumab and anti-ustekinumab antibody levels in Crohn's disease."J Gastroenterol Hepatol Res, 2019, DOI:10.1111/jgh.149628.
12 レクチン
(SeviL was isolated from Mytilisepta virgata)
- - Y. Fujii, M. Gerdol, S.M.A. Kawsar, I. Hasan, F. Spazzali, T. Yoshida, Y. Ogawa, S. Rajia, K. Kamata, Y. Koide, S. Sugawara, M. Hosono, J.R.H.  Tame, H. Fujita, A. Pallavicini and Y. Ozeki, "A GM1b/asialo-GM1 oligosaccharide-binding R-type lectin from purplish bifurcate mussels Mytilisepta virgata and its effect on MAP kinases."FEBS J., 2019, DOI: 10.1111/febs.15154..
13 モノクローナル抗体( mAb2H6, mAb10D11)  - - K. Okada, H. Itoh and M. Ikemotob, "Circulating S100A8/A9 is potentially a biomarker that could reflect the severity of experimental colitis in rats', Heliyon, 2020, 6, (2), e03470.
14 抗体
(CD31)
- - Y. Yamazaki, M. Shinohara, A. Yamazaki, Y. Ren, Y. W. Asmann, T. Kanekiyo and Guojun Bu, "SApoE (Apolipoprotein E) in Brain Pericytes Regulates Endothelial Function in an Isoform-Dependent Manner by Modulating Basement Membrane Components"Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2020, 40, (1), 128.

よくある質問

Q

Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。

A

はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗体標識プロトコル ~カスタマーサポートの視点から~」

Q

使用できるIgGの量が少量しかありませんが標識できますか?

A

本キットでは、標識に必要なIgGの量は50~200μgとしています。
この範囲であれば性能に大きな違いはありません。

10μgのIgGでも標識可能ですが、バックグランドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

Q

サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか?

A

共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標識反応にご使用ください。

<高分子:分子量1万以上>
影響する可能性があります。
BSAやゼラチンなどアミノ基をもつ化合物が含まれると、抗体への標識効率が低下します。また、高分子のためFiltration Tubeでも除くことができません。また、アミノ基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。
*本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗体の精製について、小社抗体精製キット(下記)を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A   IgG Purification Kit – G

 

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code:AP01もしくはAP02)

市販の抗体 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書に従って、精製を行う。

 

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ(Collagenase)によるゼラチン分解

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
1: ゼラチン含有IgG溶液
2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬
・コラーゲナーゼ(Sigma, #C7826) 3.5 CDU/ml 希釈溶液
・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02)
・市販の抗体 200 μg
(2)精製方法
・0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。
・37℃、3時間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。
※IgG Purification Kitでは、抗体を固定化担体に保持させる際の抗体溶液量を一回当たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗体溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを担体に保持させる操作を8回(200 μl×7, 100 μl×1)に分けて行う。
※上記の方法で得られる抗体の回収率:45~50%
 

B. 300K 限外ろ過チューブを用いたゼラチン除去

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
1: IgG
2: ゼラチン含有IgG溶液
3: 300K限外濾過のみのIgG溶液
4: 300K限外濾過+ IgG Purification Kit - Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬
・300K フィルトレーションチューブ(Pall社 ナノセップ遠心ろ過デバイス(製品コード:OD300C33)
・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02)
・市販の抗体 200 μg
(2)精製方法
・0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過を行う(200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g)。
・その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。
※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。 ゲルへの吸着操作は5回繰り返す。
※上記の方法で得られる抗体の回収率:35~45%

 

Q

低分子のタンパク質(分子量50,000以下)に標識する場合の方法を教えて下さい。

A

キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。

------------------------------------------
PALL社 ナノセップ  3K 製品No.OD003C33
PALL社 ナノセップ 10K 製品No.OD010C33 
------------------------------------------

キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することがございますので遠心時間はご検討下さい。

Q

標識後、フィルトレーションチューブを遠心してもメンブレン上に液が残る。

A

(1)メンブレンを目視で確認した際、メンブレンカップの淵にうっすら液が残る程度であれば、次の操作に進んで下さい。

メンブレン上に液が残っていたり、メンブレンカップを傾けて回転させたとき、液が垂れてくるようであれば、さらに遠心を8,000g で15分~30分程度行って下さい。

(2)1)の遠心操作後もメンブレン上に液が残る場合は、標識体が凝集していないか確認してください。

 抗体やタンパク質自身の性質によりますが、低分子標識剤を標識することで抗体やタンパク質の疎水性が増し、凝集する場合がございます。

標識体に凝集が見られる場合は、一度別のマイクロチューブに移し、遠心し上澄みをご使用ください。(抗体・タンパク質の回収量は低下いたします。)

上記でも解決しない場合は、小社カスタマーサポートまでお問い合わせください。

※フィルターの目詰まりが疑われる場合は、メンブレンフィルターを新しいものに交換すると解決する場合がございます。 
代替品: PALL社製 ナノセップ 30K (メーカーコード:OD030C33)

Q

このキットではどのようなものが標識できますか?

A

分子量が「50,000以上」で反応性のアミノ基(NH2)を有している化合物(抗体、蛋白質など)であれば標識できます。
量は「50~200μg」が対象となります。

*『mg』量の標識をお考えの際には「Biotinylation Kit (Sulfo-OSu);同仁品コード:BK01」もございます。

*キットに添付しているFiltration Tubeのサイズが30Kのため、低分子の化合物は精製できません。

Q

IgG 1分子に対して、どれくらいのBiotinが標識されますか?

A

IgG 1分子に対して平均7~10個のBiotinが標識されます。

取扱条件

取扱条件
1.保存方法:冷蔵, 2.吸湿注意
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