01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric

α-ケトグルタル酸測定キット

  • これまでの課題だったデータのバラツキと再現性を改善
  • ミトコンドリア活性の指標に
  • 代謝の変化を捉える充実のラインナップ
  • 製品コード
    K261  α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric
容 量 本体価格
100 tests ¥64,000
キット内容
100 tests ・Fluorescent Dye
・α-KG Standard
・Enzyme Mix
・Coenzyme
・Assay Buffer
・Lysis Solution
・Control Buffer
・ALT Solution
・Reaction Buffer
×1
300 µl×1
×1
×1
6.5 ml×1
2 ml×1
25 ml×1
35 µl×1
5 ml×1

性質

 α-ケトグルタル酸は、TCAサイクルの中間代謝物として重要な基質であり、グルコース代謝物のTCA回路への取り込み亢進の指標や、グルタミンを基質にα-ケトグルタル酸を供給する経路である「グルタミノリシス」亢進の指標として測定されます。また、α-ケトグルタル酸は、神経伝達物質であるグルタミン酸やγ-アミノ酪酸(GABA)の生成において重要な役割を果たすだけでなく、活性酸素種の消去にも大きく寄与していることから、近年、注目されている代謝の指標です。

30秒解説:グルコース取り込み検出キット

再生すると音声が流れます

本解説動画では、グルコース取り込み検出の目的から、従来測定法との比較・実験例を交え本製品の特徴を解説します。

技術情報

α-ケトグルタル酸の測定原理

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric は、α-ケトグルタル酸を定量するキットです。
サンプル中の α-Ketoglutarate ならびに Pyruvate との酵素反応により生成した Resorufin(Ex:530 - 560 nm、Em:580 - 600 nm)の蛍光を測定することで、細胞内のα-ケトグルタル酸を定量できます。また、本キットは96穴マイクロプレートに対応しているため、多検体測定が可能です。

測定操作

測定に用いる培養細胞の前処理からプレートリーダー測定まで、試薬を添加するだけの簡単な操作で α-Ketoglutarate(α-KG) 濃度の測定が可能です。
本キットは、既存品ご利用者の多くが不満とされていたデータの再現性を高め、初めて α-KG濃度を測定される方も安心してご利用いただけます。

データの再現性を高める2つのポイント

1)サンプルの前処理
 

既存品の前処理工程では、微量なサンプルのpH調整やフィルター処理などの煩雑な操作を必要としており、手技的なブレがデータのバラツキを招く一因となっていました。
本キットは試薬を添加するだけの簡単な操作で、前処理工程に起因するバラツキを改善しています。

 

2)α-Ketoglutarateの測定
 

α-KG濃度のプレートアッセイでは多くの場合、本キットと同様に上記①、②の反応を進行させ、生じた色素の量を測定する原理が用いられています。
既存品では2段階の反応を同時に進めることが、データのバラツキを招く一因となっていました。
本キットでは2段階の反応を完結させるプロトコルにすることで、発色反応に起因するバラツキを改善しています。

検量線の作成例

本キットの α-Ketoglutarate Standard を用い作成した検量線からサンプル中の α-ケトグルタル酸濃度を求めることができます。
グルタミン濃度が 20 μmol/l 以上の場合は、サンプルを希釈することで評価いただけます。

実験例:Doxorubicin(DOX)による細胞内代謝の変化

細胞周期のG2/M 期に作用して細胞増殖を停止させ、細胞老化を誘導することが知られているDoxorubicin(DOX) をA549 細胞へ添加後、本製品で細胞内の α-Ketoglutarate濃度を測定したところ、コントロール細胞と比較してDOX 処理細胞では細胞内の α-Ketoglutarate濃度が増加しました。
また、Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal(製品コード:SG03)で細胞老化、Cell Cycle Assay Solution Blue (製品コード:C549)/ Deep Red(製品コード:C548)で細胞周期の変化と、JC-1 MitoMP Detection Kit (製品コード:MT09)でミトコンドリア膜電位が変化することを確認しました。

実験例:Sulfasalazine (SSZ) による細胞内代謝の変化

シスチン / グルタミン酸トランスポーター (xCT) を阻害することが知られている Sulfasalazine (SSZ) を A549細胞へ添加後、細胞内のα-ケトグルタル酸、 ATP、グルタチオン (GSH)、ROSの変化と、グルタミン酸放出量の変化を確認しました。
その結果、SSZ 添加により細胞内のATP、グルタチオン(GSH)ならびにグルタミン酸放出量は減少し、細胞内のα-ケトグルタル酸とROSは増加しました。

<使用製品>
・細胞内ATP :ATP Assay Kit-Luminescence (製品コード:A550)
・細胞内GSH:GSSG/GSH Quantification Kit (製品コード:G257)
・細胞内ROS:ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- (製品コード:R252)
・グルタミン酸放出量:Glutamate Assay Kit-WST (製品コード:G269)

<実験条件>
 細胞:A549細胞 (1 x 106 cells)  暴露時間:48時間


(スケールバー:50 µm)

 

参考文献) Shogo Okazaki et al., "Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma". Cancer Sci.2019, doi:10.1111/cas.14182.

よくある質問

Q

1キットあたり測定可能なサンプル数を教えて下さい。

A

検量線の作成およびサンプルの測定をそれぞれn=3で行った場合、12サンプルの測定が可能です。
96ウェルプレートのレイアウト例については、取扱説明書をご参照ください。

Q

ブラックプレート以外のプレート(クリアプレートやホワイトプレート)での測定はできますか。

A

ホワイトプレートやクリアプレートを用いた場合、正確な検量線が作成できませんので、ブラックプレートをご使用下さい。

Q

サンプルが発色しない場合、原因として何が考えられますか?

A

本キットで定量可能な α-Ketoglutarate 濃度は 0.2 µmol/l 以上です。α-Ketoglutarate 濃度が 0.2 µmol/l 以下の測定試料は本キットでは定量できません。
また、測定試料を希釈している場合、希釈後の測定試料に含まれている α-Ketoglutarate 濃度が 0.2 µmol/l よりも低い可能性があります。
希釈倍率を下げ、測定試料の濃度を定量可能範囲内にして下さい。

Q

Working solutionは保存できますか?

A

Working solutionは保存できませんので、用時調製して下さい。
また、光に不安定であるため、調製後は遮光して下さい。
※Working solutionは調製後、遮光下であれば室温で2時間程度は安定です。

Q

測定試料は保存できますか。

A

取扱説明書の操作中、「-細胞内α-ケトグルタル酸定量用サンプルの調製-」の操作(5)の溶液は、冷凍(-20℃)で10日間の保存が可能です。
なお、冷凍保存後に沈殿を生じることがございます。その場合は遠心後の上澄みを測定試料としてください。
※Lysis Solution 20 µlを加え、ピペッティングにより混合、8000×gで10分間遠心後の上清

取扱条件

取扱条件
1.保存方法:冷蔵, 2.吸湿注意
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