01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cell Counting Kit

Cell Counting Kit

細胞増殖/細胞毒性アッセイキット

  • 製品コード
    CK01  Cell Counting Kit
容 量 本体価格 富士フイルム
和光純薬
500回用 ¥16,000 349-06461
2500回用 ¥40,000 345-06463
キット内容
500回用 ・試薬 A(凍乾品):WST-1(16.3 mg)、HEPES(20 mmol/L、pH7.4)
・溶液 B(赤色水溶液): 1-Methoxy PMS(0.2 mmol/L)
1
5 mL x1
2500回用 ・試薬 A(凍乾品):WST-1(16.3 mg)、HEPES(20 mmol/L、pH7.4)
・溶液 B(赤色水溶液): 1-Methoxy PMS(0.2 mmol/L)
5
5 mL x5

性質


本キットはWST-1および1-Methoxy PMSを組み合わせた細胞数を測定するキットである。

特 長
1) WST-1およびWST-1ホルマザンは高水溶性(0.1 mol/L以上)であり、WST-1アッセイではホルマザンを溶かす操作は不要で操作が簡便である。
2) 付着細胞、浮遊細胞ともに使用できる。
3)フェノールレッドを含む培地でも使用できる。

技術情報

試薬溶液調製法

1)溶液Bを全量注射器で吸い取り、試薬Aに注入溶解し試薬溶液とする(試薬Aは真空状態のためゴム栓を開けると試薬が飛散する恐れがある。注射器で溶液Bを注入したあとで開封する。) 
2)必要に応じて、試薬溶液は0.22 μm のメンブランフィルターで濾過滅菌する。
3)調製後の試薬溶液は4℃の暗所にで保存し、できるだけ早く使用するのが望ましい。

測定法

1)細胞をマイクロプレートに植え込み、炭酸ガスインキュベーターで前培養を行う(培地の使用量は100 μL/well、培地は RPMI1640 や MEM培地などの使用が可能である)。
2)前培養が終了し次第、試薬溶液10 μLを各ウェルに加えてよく混和する。
3)混合後、炭酸ガスインキュベーターで呈色反応を行う。(呈色反応時間は1~4 時間、細胞の種類によって異なるので充分に検討する)
4)反応後、そのままプレートリーダーで測定する。なお測定波長は450 nmもしくは405 nm、参照波長は600 nm 以上のものを使用する。
 
*使用方法はプロトコルをご覧いただきたい。

測定上の注意

1)以上の方法はほとんどの細胞について使用可能であるが、細胞によって培養時間などの条件が異なる可能性がある。
2)試薬Aは真空状態のためゴム栓を開けると試薬が飛散する恐れがある。注射器で溶液Bを注入したのちに開封する。
3)調製後の試薬溶液は4℃の暗所にて保存し、できるだけ早く使用するのが望ましい。

注意事項

1)500回用のキットは96穴マイクロプレート5枚分を目安としている。
2)細胞の種類および数により発色感度が異なるので、十分に検討の上使用する。また呈色後、以下のどちらかの方法で反応を停止することができる。
  (1)0.1 mol/L HClを10 μL添加する。
  (2)1 w/v% SDSを10 μL添加する。
  反応停止後24時間以内に測定すること。

キット以外に必要なもの

・10 μLおよび100~200 μLマルチチャンネルピペット ・CO2インキュベーター
・プレートリーダー(450 nmの吸光フィルター) ・96穴マイクロプレート

操作方法

参考文献

参考文献を表示する

1) M. Ishiyama, M. Shiga, K. Sasamoto and M. Mizoguchi, "A New Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye", Chem. Pharm. Bull.199341, 1118. 
2) 渡邉正己, "細胞増殖測定法", 組織培養, 1995, 21(12), 435.

よくある質問

Q

カタログや説明書には96wellプレートでの測定例が示してありますが、 24wellや12wellのプレートで測定を行うことができますか? その場合には試薬(Cell Counting Kit)の添加量はどのようにすれば良いでしょうか?

A

96wellプレート以外でも測定できます。

試薬の添加量は使用培地の10分の1を目安にして下さい。
(1 mLであれば試薬を100 μL など)

細胞数などにより、試薬の添加量を少なくして測定できる可能性もありますが、
最初は10分の1量を目安として検討されることをお勧めします。

Q

Cell Counting KitとCell Counting Kit-8、Cell Counting Kit-Fの違いは何ですか?

A

Cell Counting KitとCell Counting Kit-8に関しては
発色色素が違いますが、基本的な原理は同じです。
細胞内酵素活性を指標とし、比色測定を行います。
感度が高いのはCell Counting Kit-8の方です。

【Cell Counting Kit】
色素:WST-1
形態:2ボトル
*報告例が多い

【Cell Counting Kit-8】
色素:WST-8
形態:1ボトル
*CCKに比べ試薬安定性が高い。


Cell Counting Kit-Fは蛍光での測定となります。
細胞内エステラーゼ活性を指標に蛍光測定を行います。
比色法よりも少ない細胞数から測定出来ます。(50 cells/well以上)

【Cell Counting Kit-F】
色素:Calcein-AM
形態:1ボトル

Q

Cell Counting Kit(Cell Counting Kit-8)とMTTの違いは何でしょうか?

A

細胞の酵素により、テトラゾリウムがホルマザンになるというのは共通したところです。
それぞれの違いとしては

【CCKシリーズ】
生成するホルマザンが水溶性である。(溶解操作が不要)
測定波長:400~450 nm
細胞全体の酵素活性を反映している。

【MTT】
生成するホルマザンが非水溶性である。(有機溶媒等による溶解が必要)
測定波長:550~600 nm
主にミトコンドリアの酵素活性を反映している。

有機溶媒によるホルマザン溶解が必要な分、MTTの方が操作が煩雑になります。

Q

ブランク試験を行うとしたらどのような条件で吸光度を測定すればよいでしょうか? (細胞単独、細胞+培地、培地のみ、いずれも無し etc.)

A

Cell Counting Kitを用いる測定では、次の3種類のブランク測定し差し引く必要があります。

①細胞+培地にて600 nm以上で測定する。
 →細胞を含む培地の測定試料に濁りがある場合に測定します。
  濁りによる散乱が測定誤差となるためで、全波長領域で高くなります。試薬の吸収がない
  600 nm以上で測定します。しかし、濁りがない、殆ど無視できる程度の濁りであれば、
  測定する必要はありません。

②細胞+培地にて450 nm(測定波長)を測定する。
 →細胞を含む培地の測定試料に試薬の発色と同じ吸収がある場合に測定します。
  450 nmの吸収ですので、試料の着色で判断できます。着色がなければ必要はありません。

③培地+試薬(CCK)にて450 nm(測定波長)を測定する。
 →細胞を含まない培地に試薬を添加した場合の吸収を測定するもので、一般的な試薬ブランクです。
  培地に還元性物質が含まれると、試薬が発色します。そのような発色がないことを確認します。
  発色が僅かであれば、ブランクとして差し引いてもよいです。しかし、発色が強いようであれば
  培地中の還元物質を除くか、別の培地をご検討下さい。
  また、薬物添加試験を行われるのであれば、添加する薬物で発色しないかを確認してください。

*ブランクとして大きく出てくるのは②の培地に着色がある場合と③の試薬の誤発色です。
 これらをご確認ください。

Q

Cell Counting Kit の試薬A,Bの保存期間を教えてください。

A

調製前であれば、冷蔵で半年は保存可能です。
調製後は冷蔵保存しても使用可能なのは3日間です。

調製後直ちに分注して冷凍保存すれば1ヶ月間は使用可能です

Q

前培養をするように取説に指示されていますが、これは必要なものですか?

A

細胞をはがす際にトリプシン処理を行いますが、それにより細胞が弱っています。
それを再構築させるために前培養を行っていただくようにしております。

前培養することが一般的ですので、前培養なしでの測定は弊社では検討しておりません。
前培養なしで測定されたいのであれば、一度ご使用の細胞で検量線を作成してみてください。
実際に前培養なしで測定している研究者の方もいらっしゃるようです。

また、検量線作成時に前培養を行なわない場合は、実際のサンプルでも同条件で測定して下さい。

Q

Cell Counting Kitの発色に阻害を与えるような物質はなんですか?

A

一般的に還元物質(アスコルビン酸など)が共存していると正誤差が生じます。

フェノールレッドや血清は問題ありません。
フェノールレッドの場合、若干(5%程度)のブランク上昇がみられますが、使用上は問題ありません。
含有培地を用いて検量線を引いてください。

弊社におきましてもフェノールレッド含有培地を用いて検量線を引き
細胞数をちゃんとカウントすることが出来ることを確認しております。

弊社にて確認できてない培地成分もございますので、培地により誤発色しないか
確認の上、ご使用ください。(薬剤も同様です)

また薬剤によっては細胞の機能に影響を与えるものがあるようで、細胞の増殖能は止まっていても
酵素活性を働かせたりしていると(タンパク合成を行なったり)発色を起こしたりします。

負誤差の要因としては、特にこの物質が影響があるといわれているものはないのですが、
上記と逆で、薬剤により影響を受け、実際には増殖しているのに発色が低く出る
という現象が起ることはあるようです。
また、酸化剤も発色を阻害し負誤差を与える要因となることがあります。

Q

呈色反応を途中で止めたい(測定までに時間が空く)のですが、どうすれば反応を止められますか?

A

Cell Counting Kitの発色機構は細胞内に存在する脱水素酵素に依存しているので、
呈色反応を止めるには、この酵素反応を止める為に細胞を死滅させます。

下記のいずれかの方法で反応停止を行ってください(添加量は96wellの場合)
反応停止後は24時間以内に測定して下さい。

(1)1w/v% SDSを10 μL添加する。
  *SDSを添加する場合には、泡立たないように注意して下さい。
   表面に泡があると光散乱して吸光度が高くなります。
  
(2)0.1 mol/HClを10 μL添加する。
  *もし、緩衝能の高い培地をご使用の場合には、もっと濃い酸を添加してください。
   アルカリ溶液による反応停止では定量が出来ません。
   反応液をアルカリ性にすると、生成したホルマザン色素が青変し、定量性が失われます。

取扱条件

取扱条件
1.保存方法:冷蔵

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