SPiDER-βGalSG02 取扱説明書

大腸菌由来の β- ガラクトシダーゼ遺伝子 (lacZ) は、レポータージーンアッセイマーカーとして幅 広く用いられています。代表的な β- ガラクトシダーゼの検出方法として、X-gal 染色が広く利用され ていますが、細胞膜透過性が乏しいため、細胞や組織を固定化する必要があります。また、従来の β-galactosidase 検出蛍光試薬は細胞内滞留性が低いため、β-galactosidase 未発現細胞と発現細胞を明 瞭に区別できないことが課題でした。

これらの課題を克服するため、浦野、神谷らは細胞膜透過性と細胞内滞留性を有する新たな蛍光試薬 SPiDER-βGal の開発に成功しました 1)。本試薬は、β- ガラクトシダーゼとの酵素反応により、キノンメ チドと呼ばれる中間体を形成して、近傍のタンパク質中の SH 基等の求核性基と安定な共有結合を形成 し、蛍光性になります。このように、反応した試薬が細胞内タンパク質に固定化されることで優れた細 胞内滞留性を有し、その結果、β-galactosidase 発現細胞を一細胞レベルで明確に検出することが可能と なります。

図1 SPiDER-βGal の細胞染色原理

 

図2 β-galactosidase と反応後のSPiDER-βGal の励起・蛍光スペクトル

SPiDER-βGal 20 μg

x 3

0-5℃にて保存してください。

• SPiDER-βGal は、アルミラミジップに 3 本入っています。未使用の SPiDER-βGal は、アルミラミジップに入れ たまま、チャックをしっかりと閉め、0-5℃で保存してください。

• Dimethyl sulfoxide (DMSO)
• Hanks’ HEPES buffer
• マイクロピペット
• マイクロチューブ

1 mmol/l SPiDER-βGal DMSO stock solution の調製

SPiDER-βGal 20 μg を含むチューブに 35 μl の DMSO を加え、ピペッティングにより溶解する。 溶解後の SPiDER-βGal DMSO stock solution は、-20℃以下で保存する。

1 μmol/l SPiDER-βGal working solution の調製

最終濃度が1 μmol/lになるように1 mmol/l SPiDER-βGal DMSO stock solutionをHanks’ HEPES buffer 等で希釈する。

• 細胞の状態を維持するため Hanks’ HEPES buffer の使用をお勧めします。

SPiDER-βGal による細胞染色

1. 細胞をディッシュまたはチャンバーに播種し、培養する。
2. 培地を吸引除去後、Hanks’ HEPES buffer で 2 回洗浄する。
3. 調製した SPiDER-βGal working solution を添加し、37℃で 15 分間インキュベートする。
4. インキュベート後、蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで観察する。

• 染色後、洗浄操作無しでも観察できますが、必要に応じて洗浄操作を行ってください。

蛍光イメージングでの β-galactosidase 発現細胞の検出

1. 500 μl の HEK 細胞懸濁液 (5 x 10⁵ cells/ml) と 500 μl の HEK/LacZ 細胞 (β-galactosidase 安定発現株 ) 懸濁液 　(5 x 10⁵ cells/ml) を 35 mm ディッシュに DMEM 培地 (10% fetal bovine serum、1% penicillin-streptomycin) で 　播種し、5%CO₂ インキュベーターで 37℃、一晩培養した。
2. 培地を吸引除去後、2 ml の Hanks’ HEPES buffer で 2 回洗浄した。
3. 調製した SPiDER-βGal working solution 2 ml を添加し、5%CO₂ インキュベーター (37℃ ) で 15 分間インキュベートした。
4. 上澄みを吸引除去し、2 ml の Hanks’ HEPES buffer で 2 回洗浄した。
5. 2 ml の Hanks’ HEPES buffer を加え、蛍光顕微鏡で観察した。(図3 A)
6. 上澄みを吸引除去し、4% パラホルムアルデヒド (PFA)/PBS 溶液 2 ml 加え、室温で 15 分間固定化した。
7. 4%PFA/PBS 溶液を吸引除去し、2 ml の Hanks’ HEPES buffer で 2 回洗浄した。
8. 2 ml の Hanks’ HEPES buffer を加え、蛍光顕微鏡で観察した。(図3 B)

 

Filter (wavelength/band pass)
蛍光イメージング: 550/25 nm (Ex), 605/70 nm (Em)

 

蛍光イメージングの結果( 図3)、β-galactosidase を強発現しているHEK/LacZ 細胞を明瞭に観測出来ました。また、固定化後も一細胞レベルでのlacZ 細胞染色像に変化はありませんでした。

 

フローサイトメトリーでの β-galactosidase 発現細胞の検出

1. 500 μl の HEK 細胞懸濁液 (5 x 10⁵ cells/ml) と 500 μl の HEK/LacZ 細胞懸濁液 (5 x 10⁵ cells/ml) を 1.5 ml チューブ に混合した。
2. 調製した SPiDER-βGal stock solution 1 μl を添加し、37℃で 15 分間インキュベートした。
3. その細胞懸濁液をフローサイトメーターで測定した。(488 nm excitation, 530/30 nm bandpass filter)

図4 HEK/LacZ 細胞とHEK 細胞の細胞数比1:1 試料のSPiDER-βGal によるフローサイトメトリーでの分別測定

 

フローサイトメトリーの結果( 図4)、HEK 細胞とβ-galactosidase を強発現しているHEK/LacZ 細胞を明瞭に分別出来ました。

1. T. Doura, M. Kamiya, F. Obata, Y. Yamaguchi, T. Y. Hiyama, T. Matsuda, A. Fukamizu, M. Noda, M. Miura and Y. Urano, Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 9620.