Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin Labeling KitLK34 取扱説明書

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はじめに

　Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin Labeling Kitは、10µgの抗体にR-Phycoerythrinを30分以内に標識するためのキットです。Reactive R-Phycoerythrinは、活性エステル基を導入したR-Phycoerythrinであり、抗体と混合するだけで安定な共有結合を形成します。本キットには標識に必要なすべての試薬が含まれています。

 

図1 標識手順

注意

Reactive R-Phycoerythrinはアルミラミジップに3本入っています。アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のReactive R-Phycoerythrinはアルミラミジップに入れたままチャックをしっかりと閉め、-20°Cで保存してください。Reactive R-Phycoerythrin以外は、0～5°Cで保存してください。

キット内容

Reactive R-Phycoerythrin       x 3
Reaction Buffer 100 µl x 1
Stop Splution 100 µl x 1

保存条件

0～5°Cで保存してください。

ご購入後、未開封の状態で1年間安定です。

必要なもの（キット以外）

  • 20 µlマイクロピペッター
  • マイクロチューブ（サンプル調製用）
  • インキュベーター（37°C）
  • PBS（Phosphate buffered saline）

使用上の注意

  • 0.5～1 mg/mlの抗体溶液を使用してください。抗体濃度が1 mg/mlを超える場合はPBSで希釈してください。
  • 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
  • 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、開封前に溶液を遠心等でチューブの底に落としてからご使用ください。
  • 抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります。表1に標識に影響を及ぼさない添加剤の最大濃度を示しました。
表1 標識に影響を及ぼさない添加剤の最大濃度
添加剤  
Buffering agents (PBS, HEPES)  　 ◯
Sodium chloride ◯
Chelating agents (EDTA) ◯
Sugars (Glucose, Trehalose) ◯
Glycerol < 50%      
添加剤  
Sodium azide < 0.1%
BSA* < 1%
Gelatin < 0.1%
Tris < 50 mmol/l
Primary amines and thiols　   ×
  • BSAは抗体の種類により非特異吸着の原因となる場合があります。非特異吸着が著しい場合には、標識操作の前にBSAを除去することを推奨します。

プロトコール

  1. 抗体量が10 µgになるように相当する量の0.5～1 mg/mlに調製した抗体溶液をマイクロチューブに入れる。
  2. 操作1の抗体溶液にReaction Bufferを加え、ピペッティングにより混合する。
    • Reaction Bufferの添加量： 抗体溶液の1/10量（表2）
  3. 操作 2.の溶液をReactive R-Phycoerythrinに加え、ピペッティングにより混合する。
  4. 37°Cで10分間反応する。
  5. 操作 4.の溶液にStop Solutionを加え、ピペッティングにより混合する。
    • Stop Solutionの添加量： 抗体溶液の1/10量（表2）
  6. 室温で10分間反応する。
  7. 操作 6.の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。
    • 標識抗体は、4°Cで2週間は安定です。長期保存する場合には、等量のグリセロールを添加して、-20°Cで保存してください。
表2 Reaction BufferとStop Solutionの添加量
抗体濃度
（mg/ml）		 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
Reaction Buffer
添加量（µl）		 2.00 1.67 1.43 1.25 1.11 1.00
Stop Solution
添加量（µl）		 2.00 1.67 1.43 1.25 1.11 1.00

実験例

HL60細胞の蛍光染色

  1. L60細胞の細胞懸濁液を5.0×105 cells/tubeとなるようにマイクロチューブに分注した。
  2. 1,000 x gで2分間、遠心分離を行い、上清を取り除いた。
  3. Suspesion buffer [1% FBS (ウシ胎児血清)、Hank's HEPES balanced buffer] を50 µl添加した。
  4. 本キットで標識したR-Phycoerythrin標識抗体を1 µg (抗体量として) 添加し、ボルテックスにより再懸濁した。
    • 抗CD13抗体 (商品コード： 555393) はBecton Dickinson、マウス抗体 (Isotype、商品コード： 015-000-003) はJackson Immuno Research Laboratoriesより購入した。
  5. 氷上で30分間静置した。
  6. 1,000 x gで2分間、遠心分離を行い、上清を取り除いた。
  7. Suspension Bufferを1ml添加した。
  8. ボルテックスにより再懸濁し、フローサイトメーターにより蛍光強度を測定した。

図2 R-Phycoerythrin標識抗体を用いたHL60細胞の蛍光染色
a) 抗CD13抗体、b) Isotype

LK34: Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin Labeling Kit
Revised Dec., 04, 2023