Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SHLK13 取扱説明書

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はじめに

Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH は、SH基を有する分子にアルカリホスファターゼ（ALP）を標識するためのキットです。SH-Reactive Alkaline Phosphataseは、マレイミド基を導入したALPです。SH基を有する標的分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。標的タンパク質がSH基を持っていない場合、付属の還元剤を用いて遊離SH基を調製することが可能です(ただし、S-S結合の切断によってタンパク質の活性が失われる場合があります)。低分子化合物にALPを標識する場合には、未反応の低分子化合物は付属の Filtration Tubeを用いて容易に除去することができます。また、IgGのような高分子タンパクにALPを標識する場合、アルカリホスファターゼ活性を阻害するような低分子化合物（リン酸など）は、Filtration Tubeを用いた前処理によって除去されます。本キットには標識に必要なすべての試薬と作製した標識体を保存するための溶液が含まれています。

キット内容

SH-Reactive Alkaline Phosphatase 3 tubes
Solution A 4 ml x 1
Reaction Buffer 200 μl x 1
Filtration Tube 3 tubes
Reducing Agent 3 tubes
Solution B 1 ml x 1
Storage Buffer 4 ml x 1

保存条件

0～5℃で保存してください。ご購入後、未開封の状態で1年間安定です。

ご注意

SH-Reactive Alkaline Phosphataseは、アルミラミジップに３本入っています。
アルミラミジップを一旦開封した後は、未使用のSH-Reactive Alkaline Phosphataseは、アルミラミジップに入れたまま、チャックをしっかりと閉め、-20℃で保存してください。SH-Reactive Alkaline Phosphatase以外は、0～5℃で保存してください。

必要なもの (キット以外)

  • 10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
  • 遠心機（マイクロチューブ用）
  • インキュベーター（37℃）
  • マイクロチューブ（標識体保存用）

使用上の注意

  • 以下のサンプルへ標識することができます。
    ・SH基を有するタンパク質 (分子量 50,000以上; 標識タンパク量 : 50〜200 μg)
    ・SH基を有する低分子化合物 (分子量 5,000以下)
  • 試料溶液中に標識対象以外の分子量10,000以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。あらかじめ試料溶液を精製して、ご使用ください。
  • Reducing Agentは、IgGへの標識用として最適化されています。IgG以外のS-S結合を有するサンプルをご使用になる場合は、S-S結合の切断によって標識対象分子の活性が失われる場合がありますので、検討が必要です。
  • 試料溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
  • 冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、Filtration Tubeに水適様の液粒が見られることがあります。これはメンブランの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はございません。
  • 本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれています。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので、開封前に振り落としてからご使用ください。

プロトコール1

SH基を有する低分子化合物（分子量5,000以下）への標識


操作 1.
Reaction Bufferで調製した1 mmol/l サンプル溶液a) 50 μl を、SH-Reactive Alkaline Phosphataseに加える。
操作 2.
ピペッティングによりSH-Reactive Alkaline Phosphataseを溶解した後、37℃で1時間反応する。

操作 3.
Solution A 100 μlを反応溶液に加え、この溶液をFiltration Tubeに移す。
操作 4.
8,000 x gで10分間遠心するb)。

操作 5.
ろ液を捨てた後、Solution A 200 μlを加える。
操作 6.
8,000 × gで10分間遠心するb)。
再度、Solution A 200 μlを加えて、8,000 × gで10分間遠心するb)。

操作 7.
Storage Buffer 200 μlを加えて、10回程度ピペッティングし、標識体を回収するc)。マイクロチューブに移し、0～5℃で保存するd)。		  

a) サンプルが溶液の場合、10 mmol/l サンプル溶液 5 μlとReaction Buffer 45 μlを混合し、1 mmol/l サンプル溶液を調製してください。サンプルがReaction Bufferに溶解しない場合、DMSOを用いて10 mmol/lのサンプル溶液を調製し、この溶液5 μlとReaction Buffer 45 μlを混合し、1 mmol/l サンプル溶液としてください。サンプル以外にSH基を有する物質が含まれる場合には取り除いてください。

b) 溶液がメンブレン上に残っている場合には、さらに8,000×gで5分間遠心してください。

c) アルカリホスファターゼ1分子に対し、1～2分子の低分子化合物が標識されます。

d) 標識体を回収する際はStorage Bufferのご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

プロトコール 2

Immunoglobulin (IgG)への標識 a)


操作 1.
IgG 50～200 μgを含むサンプル溶液b) とSolution A 100 μlをFiltration Tubeに加える。
操作 2.
ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x gで10分間遠心するc)。

操作 3.
Solution A 150 μlをReducing Agent d)に加え、ピペッティングにより溶解する。
操作 4.
この溶液100 μlをIgGが濃縮されているFiltration Tubeのメンブレン上に加え、ピペッティングによりIgGとよく混合するe)。

操作 5.
37℃で30分間反応した後、Solution B 100 μlをFiltration Tubeに加え、8,000 x gで10分間遠心するc)。
操作 6.
ろ液を捨てた後、Solution B 200 μlをFiltration Tubeに加え、8,000 x gで10分間遠心するc)。

操作 7.
Reaction Buffer 50 μlをSH-Reactive Alkaline Phosphataseに加え、ピペッティングにより溶解するf)。
操作 8.
SH-Reactive Alkaline Phosphataseを含む溶液を還元IgGが濃縮されているFiltration Tubeのメンブレン上に加える。

操作 9.
ピペッティングによりメンブレン上のIgGとよく混合した後、37℃で1時間反応する。
操作10.
Storage Buffer 150 μlを加えて、10回程度ピペッティングし、標識体を回収するg)。マイクロチューブに移し、0～5℃で保存するh)。

a) SH基を有するサンプルの場合、還元操作(操作3～6)を省略できます。

b) 液量は100 μl以下でご使用ください。IgG濃度が0.5 mg/ml 以下の場合には、操作1と2を繰り返してIgG量が50～200 μgとなるように濃縮してください。

c) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに8,000×gで5分間遠心してください。

d) Reducing Agentがキャップの内側に付着している場合があります。開封にはご注意ください。

e) Reducing Agentによる還元反応では、IgGのヒンジ部分以外も還元される場合があります。

f) SH-Reactive Alkaline PhosphataseはReaction Buffer中で不安定です。Reaction Bufferに溶解後は直ちに操作8へ進んでください。

g) 2～4分子のアルカリホスファターゼがIgG 1分子に標識されます。未反応のアルカリホスファターゼは通常のイムノアッセイには影響を及ぼしません。希釈てご使用ください。精製が必要な場合には、ゲルろ過カラムあるいはIgGのアフィニティーカラムにより精製を行ってください。

h) 標識体を回収する際はStorage Bufferのご使用を推奨しますが、必要に応じて各種の溶液をご使用ください。

Q & A

市販の抗体を用いて標識できますか？

標識できます。ただし、安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害される場合があります。このような抗体をご使用の場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製してご使用ください。精製法について、ご不明な点がございましたらお問い合わせください。

このキットを使って抗体以外のタンパク質にアルカリホスファターゼを標識することはできますか？

分子量が5,000以下あるいは50,000以上で、SH基あるいは還元操作によって活性を失わないジスルフィド基があれば標識できます。分子量が50,000以上の場合には「IgGへの標識」のプロトコールに従ってください。分子量が5,000以下の場合には「SH基を有する低分子化合物への標識」のプロトコールに従ってください。分子量が5,000以上50,000以下の場合には、お問い合わせください。

アルカリホスファターゼ標識体はどのくらい安定ですか？

標識体の安定性はタンパク質自身の安定性に依存しますが、本キットを用いてgoat IgGに標識した場合、
4℃で2ヶ月は安定であることを確認しています。長期保存する場合には-20℃で保存してください。

このキットを使ってオリゴヌクレオチドやペプチドにアルカリホスファターゼを標識することはできますか？

分子量が5,000以下で、SH基があれば標識できます。-低分子化合物への標識-のプロトコールに従ってください。

使用できるIgGが少量しかないのですが…。

本キットは、タンパク質量50～200 μgでのご使用を推奨しておりますが、10 μgでも標識は可能です。ただし、10 μgのタンパク質を標識する場合、その後のアッセイでバックグランドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

LK13: Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH
Revised Nov., 20, 2023