Glutamine Assay Kit-WSTG268 取扱説明書

グルタミンは、TCAサイクルの中間体であるα-ケトグルタル酸の供給源であり、核酸やその他のアミノ酸合成およびエネルギー産生に利用される重要な物質です。特にがん細胞では、グルタミンを基質に、α-ケトグルタル酸を供給する経路である「グルタミノリシス」が亢進しており、グルタミノリシスは活性酸素種の消去や、酸化型グルタチオンの還元といったことに大きく寄与しているということが報告されています¹⁾。

Glutamine Assay Kit-WSTは、エネルギー代謝基質であるグルタミンを定量するキットです。細胞培養液中あるいは細胞内のグルタミンは、WSTの還元反応により定量することができ、グルタミンの定量下限は5 μmol/lです。
また、96穴マイクロプレートに対応しているため、多検体測定が可能です。

図1 Glutamine Assay Kit-WSTの測定原理

Dye Mixture	×1
Glutamine Standard (赤キャップ)	×1
Enzyme (緑キャップ)	×1
Glutaminase (黄キャップ)	20 μl×1
Reconstitution Buffer (白キャップ)	750 μl×1
Reaction Buffer	5 ml×1
Assay Buffer	7.5 ml×1
Lysis Buffer	25 ml×1
Filtration Tube	×12

• キット付属のFiltration Tubeは、細胞内グルタミンを定量する場合に使用します。本キットでは、n=3の測定で標準サンプル8点と測定用サンプル12サンプル分の測定が可能です。そのため、Filtration Tubeは12サンプル分を同梱しております。12サンプル以上の測定試料を調製する際は、別途Filtration Tube (ナノセップ遠心ろ過デバイス(10K)([OD010C33]、PALL社))をご準備頂く必要があります。

0-5 ^oCで保存して下さい。

• プレートリーダー(450 nmの吸光フィルター)
• 96 穴マイクロプレート
• インキュベーター(37 ^oC)
• 20-200 μlのマルチチャンネルピペット
• 100-1000 μl、20-200 μl、2-20 μlマイクロピペット
• PBS
• コニカルチューブ

• キットの中の試薬は、室温に戻してからご使用下さい。
• 輸送中の振動等により、内容物がスクリューキャップマイクロチューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合がありますので、内容物を底面に落とした後に開封して下さい。
• Glutaminaseは酵素懸濁液です。静置しておくと酵素が沈殿しますので、ピペッティングにより均一な懸濁液にしてご使用下さい。
• 正確な測定値を得るために、1つの測定試料につき複数(n=3以上)のウェルを使用下さい。
• Working solutionをサンプルに加えると直ちに発色が始まります。各ウェル間のタイムラグによる測定誤差を少なくするためにマルチチャンネルピペットをご使用下さい。
• 測定試料は、検量線範囲内に入るように希釈し、測定に用いて下さい。
• 本キットにはガラス製容器およびアルミ製シールキャップを使用しております。取扱いに際しては、保護手袋を着用して下さい。
• 本品は細胞培養上清中および細胞内のグルタミンの定量に最適化されています。細胞内グルタミン濃度を測定する場合、細胞溶解液の調製およびGlutamine standard solutionの調製にはキット付属のLysis Bufferをご使用下さい。また、細胞溶解液はFiltration Tubeにて除タンパク処理したものを測定に用いて下さい。

Dye Mixture stock solutionの調製

Dye Mixtureのバイアル瓶にReconstitution Bufferを全量加えて溶解する。

• Dye Mixture stock solutionはReconstitution Bufferが入っていた瓶に移し、遮光下、冷蔵保存(0-5 ^oC)して下さい(2ヶ月間安定)。

Enzyme stock solutionの調製

EnzymeにPBS 120 μlを加え、ピペッティングにより溶解する。

• 内容物がチューブ底面から外れ、チューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合があります。内容物を底面に落とした後に開封して下さい。
• Enzyme stock solutionは氷浴上で使用し、溶解後は冷蔵保存(0-5 ^oC)して下さい(2ヶ月間安定)。

Glutamine Standard stock solution (10 mmol/l)の調製

Glutamine Standardに超純水300 μlを加え、ピペッティングにより溶解する。

• 内容物がチューブ底面から外れ、チューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合があります。内容物を底面に落とした後に開封して下さい。
• Glutamine Standard stock solutionは氷浴上で使用し、溶解後は冷蔵保存(0-5 ^oC)して下さい(2ヶ月間安定)。

Glutaminase solutionの調製

GlutaminaseをReaction Bufferで希釈する。

• Glutaminase solutionは、表1をご参照の上、調製して下さい。

	24 well分	48 well分	96 well分
Reaction Buffer	550 μl	1100 μl	2200 μl
Glutaminase	2.5 μl	5 μl	10 μl

表1 Glutaminase solution調製例

Working solutionの調製

1. コニカルチューブにDye Mixture stock solutionを加え、Assay Bufferで希釈する。
2. 操作1.で調製した溶液にEnzyme stock solutionを加える。

• Working solutionは、表2をご参照の上、調製して下さい。
• Working solutionは光に不安定であるため、使用直前に調製し、調製後はアルミホイルで覆うなどして遮光して下さい。また、調製後のWorking solutionは保存できません。その日のうちにお使い下さい。

	24 well分	48 well分	96 well分
Dye Mixture stock solution	175 μl	350 μl	700 μl
Assay Buffer	1575 μl	3150 μl	6300 μl
Enzyme stock solution	24.5 μl	49 μl	98 μl

表2 Working solution調製例

1. 測定用サンプルの調製
Glutamine Assay Kit-WSTを用いたサンプル中グルタミン濃度の定量方法は、図2に示す通りです。測定用サンプル量はn=3で測定する場合、Glutaminase solutionを添加する分(40 μl×3ウェル)と、Glutaminase solutionを添加しない分(40 μl×3ウェル)の計6ウェル分が必要となります。

図2 Glutamine Assay Kit-WSTを用いたグルタミンの検出方法

 

－細胞培養上清中グルタミン定量用サンプルの調製－

細胞培養上清測定試料を準備する(Sample)。

• 測定試料は、検量線範囲内(0-0.5 mmol/l)に入るように超純水で希釈し、測定に用いて下さい。
• 測定試料はn=3で測定する場合、合計240 μl以上は必要です(1ウェルあたり40 μl×6ウェル分)。

－細胞内グルタミン定量用サンプルの調製－

1. 細胞 (5-10×10⁵ cells)を1.5 mlマイクロチューブに準備する。
2. 300×gで5分間遠心し、上清を除去する。
3. PBS 500 μlを加え、ピペッティングにより懸濁後、300×gで5分間遠心し、上清を除去する。
4. Lysis Buffer 400 μlを加え、ピペッティングにより細胞を溶解した後、12,000×gで5分間遠心する。
   • 測定用サンプルはn=3で測定する場合、合計240 μl以上は必要です(1ウェルあたり40 μl×6ウェル分)。
   • 遠心後の濾液が240 μl以上ない場合は、遠心時間を延長して下さい。
5. 上清350 μlをFiltration Tubeに移し、12,000×gで10分間遠心する。
6. 操作(5)で得られた濾液を測定に用いる(Sample)。
   • 測定試料は、検量線範囲内(0-0.5 mmol/l)に入るようにLysis Bufferで希釈し、測定に用いて下さい。

 

2. Glutamine standard solutionの調製
10 mmol/l Glutamine Standard stock solution 50 μlを超純水 950 μlで希釈し、0.5 mmol/l Glutamine standard solutionを調製する。さらに順次2倍希釈していき、標準液(0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0313, 0.0157, 0.00785, 0 mmol/l)とする(図3参照)。

• 細胞溶解溶液中のグルタミン濃度を測定する場合、超純水の代わりに、Lysis BufferをGlutaminestandard solutionの調製にご使用下さい。

図3 Glutamine standard solutionの調製方法

3. 測定

1. Glutamine standard solutionおよびSampleを40 μlずつ、各ウェルに入れる(図4参照)。
   • 正確な測定値を得るために、1つの測定試料につき複数(n=3以上)のウェルをご使用下さい。
2. Glutaminase solution 20 μlを、Glutamine standard solutionおよびSample (Glutaminase solution添加有)の各ウェルに入れる。
3. Sample (Glutaminase solution添加無)の各ウェルに、Reaction Buffer 20 μlを入れる。
4. 37^oCで15分間インキュベートする。
   • インキュベートする際は、溶液の揮発を防ぐため、マイクロプレート用シール等をご使用下さい。
5. Working solution 60 μlを各ウェルに入れる。
   • Working solutionを加えると直ちに発色が始まります。各ウェル間のタイムラグを少なくするためにマルチチャンネルピペットをご使用下さい。
6. 37 ^oCで30分間インキュベートする。
   • インキュベートする際は、溶液の揮発を防ぐため、マイクロプレート用シール等をご使用下さい。
7. プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定する。
8. 測定試料(Sample)中のグルタミン濃度を検量線より求める。
   • 測定試料中のグルタミン濃度は以下の計算式より算出します。
     グルタミン濃度(mmol/l)＝(Glutaminase solution添加有)－(Glutaminase solution添加無)
   • これにより求められた値は、調製した測定試料溶液中の濃度です。希釈前の試料中に含まれる濃度は、得られた測定値と試料の希釈倍率より算出して下さい。

Doxorubicin処理により老化誘導したA549細胞のグルタミン消費量評価

1. A549細胞(2×10⁷ cells/dish、10% fetal bovine serum、1% penicillin-streptomycinを含むDMEM培地)を10 cmディッシュに播種し、37^oC、5%CO₂インキュベーターで一晩培養した。
2. 培地を吸引除去し、DMEM培地で希釈した200 nmol/lのDoxorubicin溶液10 mlを加え、37^oC、5%CO₂インキュベーターで2日間培養した。
3. 培地を吸引除去し、PBS 2 mlで1回洗浄した。
4. トリプシン処理により細胞を剥がした後、DMEM培地でコニカルチューブに回収した。
5. Doxorubicin処理あり、なしのA549細胞をそれぞれ6穴プレートに播種(1×10⁶ cells/well、10% fetal bovine serum、1% penicillin-streptomycinを含むDMEM培地)し、37^oC、5%CO₂インキュベーターで一晩培養した。
6. 培地を吸引除去し、2 mmol/lグルタミンを含むDMEM培地2 mlを加え、37^oC、5%CO₂インキュベーターで一晩培養した。
7. 1.5 mlマイクロチューブに細胞培養上清を100 μl取り、超純水で15倍希釈したものを調製した。
   • グルタミン消費量を求めるため、2 mmol/l グルタミンを含むDMEM培地のみを超純水で15倍希釈したものも測定試料とした。
8. Glutamine standard solutionを調製し、標準液を調製した(Glutamine standard solutionの調製参照)。
9. 調製した測定試料(DMEM培地のみ、doxorubicin処理あり、なしの細胞培養上清)およびGlutamine standard solutionを40 μlずつ、96穴マイクロプレートに入れた。
10. 調製したGlutaminase solution 20 μlを、Glutamine standard solutionおよびサンプル(Glutaminase solution添加有)の各ウェルに加えた。
11. Glutaminase solution添加無のサンプルの各ウェルには、Reaction Buffer 20 μlを加えた。
12. 37^oCで15分間インキュベートした。
13. 調製したWorking solution 60 μlを各ウェルに加えた。
14. 37^oCで30分間インキュベートした。
15. プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定し、測定試料中グルタミン濃度を検量線より求めた。測定試料中のグルタミン濃度は以下の計算式より算出した。

    グルタミン濃度(mmol/l)＝(Glutaminase solution添加有)－(Glutaminase solution添加無)

    また、細胞(10⁴ cells)あたりのグルタミン消費量については、以下の計算式より算出した。

    グルタミン消費量(nmol/104 cells)＝ 　(DMEM培地中グルタミン量(nmol))－(doxorubicin処理ありまたはなし培養上清中グルタミン量(nmol))

    細胞数

• グルタミン消費量(nmol)＝(算出したグルタミン濃度(mmol/l))×(6穴プレートに添加した培地量(2 ml))

図6 Doxorubicin(DOX)処理により老化誘導したA549細胞のグルタミン消費量評価

Doxorubicin処理により、A549細胞の細胞培養上清中グルタミン消費量は増加することを確認した。

1. Lingtao, J. et al., Cancer Cell, 2015, 27, 257-270.