Extracellular OCR Plate Assay KitE297 取扱説明書

　酸素は、主にミトコンドリアの酸化的リン酸化でアデノシン三リン酸 (ATP) が産出される過程で消費されるため、その酸素消費速度 (OCR: Oxygen Consumption Rate) はミトコンドリア機能解析の指標となっています。がん細胞では酸化的リン酸化より非効率な解糖系を用いてATPを産出することが知られています。また、免疫細胞では酸化的リン酸化が優位の場合、抗腫瘍効果を阻害するのに対し、解糖系が優位の場合は、抗腫瘍効果を促進することが分かってきています。それらのエネルギー代謝の指標として、細胞のOCRが測定されています。
　Extracellular OCR Plate Assay Kitは、培養細胞のOCRを測定することができるキットで、培地中の酸素濃度が低下すると、りん光強度が高くなる特性を持つOxygen Probeと空気中の酸素流入を遮断するためのMineral Oilを同梱しています。本キットは、専用の装置や培地、プレート等を必要とせず、汎用の蛍光プレートリーダーやマイクロプレートでの測定が可能です。

図1　Extracellular OCR Plate Assay Kit の測定原理

-20 ^oC で保存して下さい。

• マイクロプレートリーダー (温度調節機能がついているもの)
• 96穴黒色クリアボトムマイクロプレート
• 20 - 200 μlのマルチチャンネルピペット
• 100 - 1000 μl、20 - 200 μl、2 - 20 μl マイクロピペット
• 1.5 ml マイクロチューブ
• コニカルチューブ
• ヒートブロックもしくは恒温槽

• キットの中の試薬は、室温に戻してからご使用下さい。
• 輸送中の振動等により、内容物がチューブ壁面やキャップ裏面に付着している場合がありますので、内容物を底面に落とした後に開封して下さい。
• 正確な測定値を得るために、1つの測定試料につき複数 (n=3 以上) のウェルをご使用下さい。
• プレートリーダーは、測定前に37 ^oCに設定して下さい。
• Mineral Oilや希釈したsample solutionは、ヒートブロックもしくは恒温槽で予め37 ^oC付近に温めてご使用下さい。
• 96穴マイクロプレートを用いる場合は、以下の細胞数を目安に数種類調製し、最適細胞数を決定する予備実験を行って下さい。
  浮遊細胞 (400,000 cells/well)
  付着細胞 (50,000 cells/well) 
  実験例②に、HEK293細胞を用いた最適細胞数の検討方法を記載しております。詳細はそちらをご覧下さい。

working solution の調製

• 血清を含む培地を使用して下さい。

1. 表1を参考にOxygen Probe を培地で希釈する。
2. 必要量のworking solution を調製する。

• working solution は光に不安定であるため使用直前に調製し、調製後はアルミホイルで覆うなどして遮光して下さい。

表1　working solution の調製例

	15 wells	30 wells	45 wells	60 wells	75 wells	90 wells
Oxygen Probe	16.5 μl	33 μl	49.5 μl	66 μl	82.5 μl	99 μl
培地	1483.5 μl	2967 μl	4450.5 μl	5934 μl	7417.5 μl	8901 μl

 

-予備実験(細胞数の最適化)-

96穴マイクロプレートを用いる場合は、以下の細胞数を目安に数種類調製し、最適細胞数を決定する予備実験を行って下さい。
浮遊細胞(400,000 cells/well)
付着細胞(50,000 cells/well)
実験例②に、HEK293細胞を用いた最適細胞数の検討方法を記載しております。詳細はそちらをご覧下さい。

図2　予備実験から本実験を行うまでの流れ

-本実験-

〈浮遊細胞〉

同一細胞種・細胞数においてsample の種類や濃度を検討する場合


細胞種を検討する場合


細胞数を検討する場合

図3　プレートレイアウト例 (n=3)

 

表2　各ウェルに必要なサンプル及び試薬の添加量

	Blank 1	Blank 2	Blank 3	Control	Sample
培地	110 μl	10 μl	10 μl	10 μl	-
working solution	-	100 μl	-	-	-
細胞 (培地に懸濁)	-	-	100 μl	-	-
細胞 (working solution に懸濁)	-	-	-	100 μl	100 μl
Sample solution	-	-	-	-	10 μl
Mineral Oil	1 滴	1 滴	1 滴	1 滴	1 滴

• 血清を含む培地を使用して下さい。

1. 表2 を参考にBlank 3 として細胞(予備実験にて決定した最適細胞数) を培地に懸濁し、Control やSample として細胞(予備実験にて決定した最適細胞数) をworking solution に懸濁したものを用意し、図3 のレイアウト図を参考に、96 穴黒色クリアボトムマイクロプレートに100 μlずつ播種する。
   • 正確な測定値を得るために、1 つの測定試料につき複数(n=3 以上) のウェルをご使用下さい。
2. 図3 のレイアウト図を参考に、Blank 1 には培地を100 μl 、Blank 2 にはworking solution を100 μl 添加する。
3. 予め37 ^oC に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、30 分間インキュベーションする。
   • インキュベーターではなく、プレートリーダーにてインキュベーションして下さい。
4. Blank 1、Blank 2、Blank 3、Control に培地を10 μl ずつ添加する。
   • 培地は37 ^oC 付近になるように、ヒートブロックや恒温槽で予め温めておいて下さい。
5. Sample には、培地で希釈したsample solution を10 μl ずつ添加する。
   • 希釈したsample solution は37 ^oC 付近になるように、ヒートブロックや恒温槽で予め温めておいて下さい。
6. sample solution 添加後は、直ちにMineral Oil を1 滴ずつ各ウェルに滴下する。
   • Mineral Oil は37 ^oC 付近になるように、ヒートブロックや恒温槽で予め温めておいて下さい。
7. 37 ^oC に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、5 分間インキュベーションする。
   • インキュベーターではなく、プレートリーダーにてインキュベーションして下さい。
8. 蛍光マイクロプレートリーダーを用いて強度をタイムコースで10 分毎に200 分間測定する
   (Ex: 500 nm, Em: 650 nm, Bottom リーディング)。
9. ダウンロードした専用の計算シートに得られた強度の値を入力し、OCR 値を算出する。

 

〈付着細胞〉

同一細胞種・細胞数においてsample の種類や濃度を検討する場合


細胞種を検討する場合


細胞数を検討する場合

図4　プレートレイアウト例 (n=3)

 

表3　各ウェルに必要なサンプル及び試薬の添加量

	Blank 1	Blank 2	Blank 3	Control	Sample
培地	110 μl	10 μl	110 μl	10 μl	-
working solution	-	100 μl	-	100 μl	100 μl
Sample solution	-	-	-	-	10 μl
Mineral Oil	1 滴	1 滴	1 滴	1 滴	1 滴

• 血清を含む培地を使用して下さい。

1. 図4 のレイアウト図を参考に、Blank 3、Control、Sample に細胞(予備実験にて決定した最適細胞数) を100 μlずつ96穴黒色クリアボトムマイクロプレートに播種する。
   • 正確な測定値を得るために、1つの測定試料につき複数 (n=3 以上) のウェルをご使用下さい。
   • OCR 測定後に核染色剤 (Hoechst 33342) によるウェル当たりの細胞数を算出する場合は、検量線作成用のウェルにも細胞播種して下さい。よくある質問に付着細胞での測定例がございますので、詳細はそちらをご覧下さい。
2. インキュベーター (37 ^oC、5%CO₂ 存在下) で一晩培養する。
3. 細胞を剥がさないように注意しながら、ウェル中の培地を除去する。
4. 図4 のレイアウト図を参考に、Blank 1、Blank 3 には培地を100 μl 、Blank 2、Control、Sampleにはworking solutionを100 μl 添加する。
5. 予め37 ^oC に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、30 分間インキュベーションする。
   • インキュベーターではなく、プレートリーダーにてインキュベーションして下さい。
6. Blank 1、Blank 2、Blank 3、Controlに培地を10 μlずつ添加する。
   • 培地は37 ^oC 付近になるように、ヒートブロックや恒温槽で予め温めておいて下さい。
7. Sample には、培地で希釈したsample solutionを10 μlずつ添加する。
   • 希釈したsample solution は37 ^oC 付近になるように、ヒートブロックや恒温槽で予め温めておいて下さい。
8. sample solution 添加後は、直ちにMineral Oil を1滴ずつ各ウェルに滴下する。
   • Mineral Oil は37 ^oC 付近になるように、ヒートブロックや恒温槽で予め温めておいて下さい。
9. 37 ^oCに設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、5分間インキュベーションする。
   • インキュベーターではなく、プレートリーダーにてインキュベーションして下さい。
10. 蛍光マイクロプレートリーダーを用いて強度をタイムコースで 10 分毎に 200 分間測定する (Ex: 500 nm, Em: 650 nm, Bottom リーディング)。
11. ダウンロードした専用の計算シートに得られた強度の値を入力し、OCR値を算出する。

• 本計算シートは、取扱説明書に記載している操作手順 (ウェル条件や温度、液量) で測定を行った場合のみ適用できます。

1. 測定したデータの各時間におけるウェル条件ごとの強度の平均値を算出し、専用の計算シートの橙色の枠内に入力する (3-34 行目) 。
   
2. 操作1. を入力すると、各条件における強度と酸素量 (nmol) の値が自動的に計算される。
3. グラフにおいて直線性の得られる範囲の酸素量 (nmol) と時間 (min) を選択し、ウェル当たりの酸素消費速度 (nmol/min) を算出する。
   橙色の枠内に下記の計算式を入力
   = -SLOPE (既知のy、既知のx)

   既知のy : 直線性の得られる酸素量 (nmol) の範囲 既知のx : 直線性の得られる時間 (min) の範囲

   (例) Untreated:「 = -SLOPE(D71:F71,D70:F70)」
   　　 Sample 1:「= -SLOPE(D72:F72,D70:F70)」
   
4. 操作3. を入力すると、ウェル当たりのOCR の単位を nmol/min から pmol/min へ変換した値が表に自動入力される。
   • 細胞数で補正したOCRが必要な場合は、細胞数カウントや核酸量測定等を行って下さい。

HepG2細胞を用いたFCCP (脱共役剤) 処理によるOCRの変化

1. HepG2細胞を5.0×10⁵ cells/ml になるようにDMEM培地(10% FBSを含む) で希釈し、96穴黒色クリアボトムマイクロプレートに100 μl ずつ播種した。
2. インキュベーター(37 ^oC、5%CO_²存在下) で一晩培養した。
3. 細胞を剥がさないように注意しながら、ウェル中の培地を除去した。
4. DMEM培地(10% FBSを含む) とworking solution をそれぞれのウェルに100 μl ずつ添加した。
5. 予め37 ^oC に設定したプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、30 分間インキュベートした。
6. Blank 1、Blank 2、Blank 3、Control: DMEM培地 (10% FBS を含む)、Sample: DMEM培地 (10% FBSを含む) で希釈したFCCP を10 μl ずつ各ウェルに添加した。
7. 薬剤添加後、直ちにMineral Oil を1滴ずつ全てのウェルに滴下した。
8. 37 ^oC に設定したプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、5 分間インキュベートした。
9. 強度をタイムコースで10 分毎に200 分間測定した (Ex: 500 nm, Em: 650 nm, Bottomリーディング) 。
10. 得られた強度の値を専用の計算シートに入力し、OCR値を算出した。

図5　FCCP (脱共役剤) によるOCR値の変化
FCCPを添加することによってOCR値は増加し、FCCPが高濃度になるとOCR値は減少することを確認した。

HEK293細胞を用いた最適細胞数の検討

1. HEK293細胞を5.0×10⁵ cells/ml、7.0×10⁵ cells/ml、2.0×10⁶ cells/ml になるようにMEM培地(10% FBSを含む)で希釈し、96穴黒色クリアボトムマイクロプレートに100 µl ずつ播種した(図6参照)。

   図6　プレートレイアウト例(n=3)

2. インキュベーター(37 ^oC、5%CO_²存在下) で一晩培養した。
3. 細胞を剥がさないように注意しながら、ウェル中の培地を除去した。
4. MEM培地(10% FBSを含む) とworking solution をそれぞれのウェルに100 μl ずつ添加した。
5. 予め37 ^oC に設定したプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、30 分間インキュベートした。
6. Blank 1、Blank 2、Blank 3、Control: MEM培地(10% FBS を含む)、FCCP 1 µmol/l、FCCP 2 µmol/l、FCCP 4 µmol/l: MEM培地(10% FBSを含む) で希釈したFCCP を10 μl ずつ各ウェルに添加した。
7. 薬剤添加後、直ちにMineral Oil を1滴ずつ全てのウェルに滴下した。
8. 37 ^oC に設定したプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、5 分間インキュベートした。
9. 強度をタイムコースで10 分毎に200 分間測定した (Ex: 500 nm, Em: 650 nm, Bottomリーディング) 。
10. 得られた強度の値を専用の計算シートに入力し、OCR値を算出した。

図7　細胞数ごとのOCR値の変化

HEK293細胞における最適細胞数は7.0×104 cells/well だと分かった。