Calcium Kit - Fluo 4CS22 取扱説明書

Calcium Kit - Fluo 4 は、細胞内Ca²⁺ 測定試薬であるFluo 4-AMと、その測定に必要なBuffer 等を組み込んだスクリーニングキットです。細胞種や添加する薬剤などに応じて、Pluronic® F-127 またはCremophor® EL（Fluo 4-AM の溶解補助剤）、Probenecid（陰イオントランスポーターの阻害剤）の各濃度を任意に設定できます。ハイスループットスクリーニングに用いられる蛍光プレートリーダーやインジェクターを備えた各種プレートリーダーでは薬剤添加による細胞内カルシウムイオン濃度変化をリアルタイムで測定可能です。

Fluo 4-AM

冷凍にて保存してください。ご購入後、1年以内にご使用ください。

• Fluo 4-AM Dimethylsulfoxide 溶液、Loading Buffer 及びRecording Medium は、用時調製してください。
• Fluo 4-AM をDimethylsulfoxide に溶かした状態で長期保存しますと、Fluo 4-AM が分解する可能性がございます。
  Loading Buffer は、出来るだけ1 回の操作で使い切ることをお薦めします。
• 細胞内カルシウムイオンの濃度をより正確に測定したい場合は、姉妹品Calcium Kit - Fura 2 のご使用をお薦めします。ただし、340 nm/380 nm の二波長励起出来る装置が必要になります。

1. 細胞の培養

マイクロプレートの各ウェルに細胞浮遊液を分注し、炭酸ガスインキュベーター内で一晩培養する。

• 付着細胞を使用する際は、96 穴プレートでは15,000 〜40,000 cells/well、384 穴プレートでは5,000 〜 15,000 cells/well 程度の細胞を一晩培養して使用することをお薦めします。
• 培養に用いる培地の量は、96 穴プレートで100 μl/well、384 穴プレートで25 μl/well をお薦めします。

 

2. Loading Buffer の調製 (96 穴マイクロプレート 1 枚分)

1. 添付のDimethylsulfoxide から 50 μl を分取し、Fluo 4-AM 1 本（50 μg）に加え、よく溶解する。
2. 10 ml スケールの容器を準備する。Recording Medium（2X）5 ml を取り、測定条件に応じて、任意の 量^※の5% Pluronic® F-127（または5% Cremophor® EL）、250 mmol/l Probenecid を添加し、これに全量が10 ml となるように純水を加え、よく混合する（本キットは予め、測定に最適なpH7.4 付近となるよう構成してあります）。
3. Fluo 4-AM のDimethylsulfoxide 溶液(50 μl) を添加して、超音波などでよく溶解し、Loading Buffer とする。

• 推奨濃度をProbenecid: 1.25 mmol/l 、Pluronic® F-127: 0.04 % としてありますが、濃度の変更は可能です。

Loading Buffer 10 ml を調製する場合、Probenecid、Pluronic® F-127 ( またはCremophor® EL) のアッセイ時の最終濃度と、添加量の関係は以下のようになります。

 

3. Recording Medium (1X) の調製 (96 穴マイクロプレート 1 枚分）

1. 別途、10 ml スケールの容器を準備する。Recording Medium（2X）5 ml に、測定条件に応じて、任意の量^※250 mmol/l Probenecid を添加し、これに全量が10 ml となるように純水を加え、よく混合する（本キットは予め、測定に最適なpH7.4 付近となるよう構成してあります）。
2. 37℃ インキュベーター中で加温しておく。

• 推奨濃度をProbenecid: 1.25 mmol/l としておりますが、濃度の変更は可能です。

Recording Medium（1X） 10 ml を調製する場合、Probenecid のアッセイ時の最終濃度と、添加量の関係は以下のようになります。

250 mmol/l Probenecid 溶液の添加量と最終濃度
添加量(μl)	20	30	40	50	60
最終濃度(mmol/l)	0.50	0.75	1.00	1.25	1.50

 

4. 細胞へのFluo 4-AM のロード

1. 細胞を傷つけないように培地を取り除いた後、96 穴プレートで100 μl/well、384 穴プレートで25 μl/well のLoading Buffer を、それぞれのウェルに加える（必要に応じて、Loading Buffer を添加する前に、37℃ に加温したPBS で細胞を洗浄して下さい）。
2. 37°C で1 時間、インキュベートする。
3. 細胞を傷つけないようにLoading Buffer を取り除き、予め37°C に加温しておいたRecording Medium (1X) を、96 穴プレートで100 μl/well、384 穴プレートで25 μl/well ずつ加える（必要に応じて、Recording Medium を添加する前に、37°C に加温したPBS で細胞を洗浄して下さい）。
4. 薬剤添加による蛍光強度変化を、各種蛍光プレートリーダーで測定する。
   （λ_ex = 480 ～ 500 nm, λ_em = 518 nm）