-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit - CFDA/PIBS10 取扱説明書

-Bacstain- Bacterial Viability Detction Kitは細菌を対象とした蛍光二重染色が可能な製品群です。下記に示した、異なる三つの染色原理をもつ蛍光染色試薬を組み合わせることで、それぞれの指標における二重染色画像が取得できます。
細菌の生存率は一般的には寒天培地を用いたコロニー形成法によって評価されますが、この手法では培養に長時間要することや、viable but nonculturable(VNC)状態の菌では生育が認められないといった問題点があります。
一方、蛍光染色法は細菌を培養することなく迅速・簡便に染色し、生存率の評価を行うことが可能です。
-Bacstain- Bacterial Viability Detction Kit -CFDA/PIは、細菌のエステラーゼ活性と膜損傷の指標を用いた生存率検出キットです。本キットに含まれるCFDAは細胞内のエステラーゼにより加水分解されカルボキシフルオレセインとなり蛍光を発します。
PIはDNA二重らせんの塩基対間に平行挿入するインターカレーターであり、正常な膜を持つ細胞内には透過せず、損傷した膜を持つ細胞にのみ透過し核酸を染色します。
このことから、本製品では、それぞれの染色画像を解析することでエステラーゼ活性をもつ細菌と膜損傷菌の比率を求めることができます。

三つの染色原理：膜損傷、呼吸活性およびエステラーゼ活性を持つ細菌の染色指標の組み合わせ

コード	製品名	組み合わせ
BS08	-Bacstain- Bacterial Viability Detction Kit -DAPI/PI	全菌/膜損傷
BS09	-Bacstain- Bacterial Viability Detction Kit -CTC/DAPI	呼吸活性/全菌
BS10	-Bacstain- Bacterial Viability Detction Kit -CFDA/PI	エステラーゼ活性/膜損傷

 

CFDA Solution (DMSO溶液)	375 μl x 4
PI Solution	25 μl x 4

-20 ℃ 以下にて保存して下さい。

 

• インキュベーター
• マイクロピペット(1000 μl, 1–20 μl)
• PBS(-)または生理食塩水
  • グラム陰性菌はグラム陽性菌に比べCFDAで染色し難い傾向にあります。細胞外膜の存在によりCFDAが細胞内に透過し難いためです。グラム陰性菌を染色する際は、下記に示す0.1 mol/lのリン酸バッファーの使用を推奨します。
    0.1mol/l-Phosphate buffer(pH8.5, 5%(w/v)-NaCl, 0.5 mmol/l-EDTA disodium salt)
• ホルムアルデヒド(終濃度1-4%)
• 蛍光顕微鏡

本キットには溶液の入ったマイクロチューブのコンポーネントが含まれます。チューブ内壁やキャップに溶液が付着していることがありますので開封前に遠心等によりチューブの底部に落としてからご使用ください。

プロトコルに準じた場合、本キット4本組で約100検体分の測定が可能です。

1. CFDA SolutionおよびPI Solutionを30分間遮光下で静置し、室温に戻す。
   • PIは変異原性が疑われるため操作および廃棄には注意が必要です。
2. 細菌をPBS(-)または生理食塩水に懸濁し、細菌の密度を 10⁸-10⁹ cells/ml に調整する。
3. 細胞懸濁液 1 ml をマイクロチューブに移す。
4. 細胞懸濁液を遠心分離する(5,000 × g、5分間)
5. 上澄みを除去し、PBS(-)または生理食塩水 1 ml を加え懸濁する。
6.  4., 5.の手順を2回繰り返す。
7. 細胞懸濁液1 mlに対しCFDA Solutionを 15 μl加えボルテックスミキサーで混合する。
8. 37 ℃ にて 5分間 インキュベートする。(終濃度：0.32 mmol/l)
   • CFDAによる染色が十分に確認できない場合はインキュベーション時間を延長してください。
9. 細胞懸濁液1 mlに対しPI solutionを1 μl加えよく混合する。(終濃度：1.4 μmol/l)
10. 室温にて5分間インキュベートする。
11. 染色した細胞懸濁液 を遠心分離する(5,000 x g、5分間)。
12. 上澄みを除去し、ホルムアルデヒドを1 ml加え懸濁する。
13. 室温にて10分間静置し、細胞を固定化する。
14. 固定化した細胞懸濁液を遠心分離する(5,000 x g、5分間)。
15. 上澄みを除去し、PBS(-)または生理食塩水 1 ml を加え再懸濁する。
16. 蛍光顕微鏡で観察する。

励起波長と蛍光波長

コンポーネント名	Maximum Ex/Em	推奨フィルター	励起波長	蛍光波長
CFDA Solution	493/515	GFP	430-510 nm	475-575 nm
PI Solution	530/620	TRITC	520-570 nm	535-675 nm

Staphylococcus aureus( グラム陽性菌) の二重染色実験

1. 液体培地(TSBYE) 5 ml を入れた試験管を2 本準備し、細菌を培養(37 ℃、14 ～ 16 時間) した。1 本を生菌サンプルとし、もう1 本を滅菌済サンプル( オートクレーブ滅菌 121 ℃、30 分) とした。
2. 培養後、菌をPBS(-) または生理食塩水に懸濁し、細菌の密度を 10⁸-10⁹ cells/ml に調整した。生菌サンプルと滅菌済サンプルを7:3 の割合で混合し、実験用サンプルとした。
3. 細胞懸濁液 1 ml をマイクロチューブに移した。
4. 細胞懸濁液を遠心分離した(5,000 x g、5 分間)。
5. 上澄みを除去し、PBS(-) または生理食塩水 1 ml を加え懸濁した。
6.  4., 5. の手順を2 回繰り返した。
7. 細胞懸濁液にCFDA Solution を15 μl 加えボルテックスミキサーで混合した。
8. 37 ℃にて5 分間インキュベートした。
9. 細胞懸濁液にPI Solution を1 μl 加えよく混合した。
10. 室温にて5 分間インキュベートした。
11. 染色した細胞懸濁液 を遠心分離した(5,000 x g、5 分間)。
12. 上澄みを除去し、ホルムアルデヒド( 終濃度1-4%) を1 ml 加え懸濁した。
13. 室温にて10 分間静置し、細胞を固定化した。
14. 固定化した細胞懸濁液を遠心分離した(5,000 x g、5 分間)。
15. 上澄みを除去し、PBS(-) または生理食塩水 1 ml を加え再懸濁した。
16. 落射型蛍光顕微鏡で観察した。

 

CFDA によりエステラーゼ活性を有する細菌を染色( 青) し、PI により膜損傷した細菌を染色( 赤) したことが確認できる。

Escherichia coli ( グラム陰性菌) の二重染色実験

1. 液体培地(TSBYE) 5 ml を入れた試験管を2 本準備し、細菌を培養(37 ℃、14 ～ 16 時間) した。1 本を生菌サンプルとし、もう1 本を滅菌済サンプル( オートクレーブ滅菌 121 ℃、30 分) とした。
2. 培養後、菌をPBS(-) または生理食塩水に懸濁し、細胞密度を 10⁸-10⁹ cells/ml に調整した。生菌サンプルと滅菌済サンプルを1:1 の割合で混合し、実験用サンプルとした。
3. 細胞懸濁液 1 ml をマイクロチューブに移した。
4. 細胞懸濁液を遠心分離した(5,000 × g、5 分間)。
5. 上澄みを除去し、0.1 mol/l リン酸バッファー^※1 ml を加え懸濁した。
   • 0.1 mol/l-Phosphate buffer (pH8.5, 5%(w/v)-NaCl, 0.5 mmol/l-EDTA disodium salt)
6.  4., 5. の手順を2 回繰り返した。
7. 細胞懸濁液にCFDA Solution を 15 μl 加えボルテックスミキサーで混合した。
8. 37℃にて5 分間インキュベートした。
9. 細胞懸濁液にPI Solution を1 μl 加えよく混合した。
10. 室温にて5 分間インキュベートした。
11. 染色した細胞懸濁液 を遠心分離した(5,000 x g、5 分間)。
12. 上澄みを除去し、ホルムアルデヒド( 終濃度1-4%) を1 ml 加え懸濁した。
13. 室温にて10 分間静置し、細胞を固定化した。
14. 固定化した細胞懸濁液を遠心分離した(5,000 x g、5 分間)。
15. 上澄みを除去し、0.1 mol/l リン酸バッファー 1ml を加え再懸濁した。
16. 落射型蛍光顕微鏡で観察した。

CFDA によりエステラーゼ活性を有する細菌を染色( 緑) し、PI により膜損傷した細菌を染色( 赤) したことが確認できる。