BS3/DSP/DTSSPB574_D629_D630 取扱説明書

BS3, DTSSP, DSP は、アミノ基同士の架橋反応が可能な試薬である。N- ヒドロキシスクシンイミド活性エステ ルを分子の両端に有しており、アミノ基に対して選択的に反応するため、酵素標識体の調製や単純ハプテンを担体タンパク質に結合することが可能である。

BS3 はリンカー部分にアルキル鎖を有する化学構造をとる。一方、DSP および DTSSP は、リンカー部位にジ スルフィド基が導入されていることで還元剤により容易に還元されリンカー部位の切断が可能である。また、 BS3 および DTSSP は、スルホン酸基を有する活性エステル基が導入されているため、試薬を溶解するためのdimethylformamide や dimethylsulfoxide など有機溶媒を用いることなく標識反応を行うことが可能である。

吸湿を避けて、0～5°Cにて保存してください。

• BS3, DSP, DTSSP を溶解した溶液は保存できません。用時調製でご使用ください。

• マイクロピペット (10 μl、200 μl)
• 有機溶媒 (dimethylsulfoxide など）
• インキュベーター
• 緩衝液（PBS など）
• マイクロチューブ
• 精製用ゲルなど

クロスリンカーの濃度	BS3 5 mgを溶解する溶媒量	DTSSP 5 mgを溶解する溶媒量	DSP 5 mgを溶解する溶媒量
5 mmol/l	1747 μl	1643 μl	2473 μl
10 mmol/l	873 μl	822 μl	1236 μl
50 mmol/l	175 μl	164 μl	247 μl
100 mmol/l	87 μl	82 μl	124 μl

① タンパクサブユニットの架橋

1. HEPES 緩衝液 (10 mmol/l、pH7.5,120 mmol/l NaCl、3 mmol/l MgCl₂、1 mmol/l DTT）を調製する。
2. 4 μmol/l サブユニット A と 25 μmol/l サブユニット B を 1. で調製した緩衝液に溶解する。
3. BS3、DTSSP または DSP を 2 ~ 4 mmol/l 濃度で添加する。^※
4. 1～10 分間、25°Cで反応させる。
5. Tris 緩衝液（10 mmol/l、pH7.4, 570 mmol/l グリシン）を加え反応を停止する。

• BS3 と DTSSP は使用直前に緩衝液に溶解して下さい。DSP は DMSO に溶解して下さい。

 

② S-S 結合の開裂（DTSSP、DSP の場合）

1. β- メルカプトエタノールを添加し S-S 結合を開裂する。
2. 10 mmol/l ヨードアセトアミドに置換し、フリーの SH 基を保護する。

【BS3, DSP, DTSSP を用い、複合体を作製した使用例】
詳細な実験条件につきましては該当する参考文献をご覧ください。

表 1 BS3, DSP, DTSSP を用いたアプリケーションと論文

架橋剤	論文の内容	文献
BS3	ツメガエルガラクチンの結晶構造解析 X線構造解析を行うと共にxgalectin-VaとBS3を反応させ、四量体構造が糖認識機能を有していることを確認	1)
	ノロウイルスのカプシドタンパク質二量体(P-domain)と血液型抗原受容体への結合評価 P-タンパク質の二量体を各種条件（濃度、pH)で作製し、安定性等を評価	2)
	BSAの三次元構造解析 BSAを架橋させ、その三次元構造をMass解析	3)
BS3, DTSSP	オリゴペプチド誘導体の受容体解析 125I化Phytophthora megasperma f.sp. glycines(Pep-13)をparsley microsomeと架橋させその受容体の局在や機能を解析	4)
	酵素およびサブユニットの相互作用解析 cGMP-phosphodiesterase(PDE)とG-protein transducinのサブユニットを架橋、電気泳動による結果をもとに架橋条件の検討および解析	5)
BS3, DTSSP, DSP	RGDペプチドと血小板レセプターの相互作用解析 GPⅡb-ⅢaとFibrinogen-7を架橋させSDS-PAGEにて解析。そのためにヨウ素標識したfibronectinを使用	6)
DSP	F0F1-ATP synthaseの解析 ATPase subunitをDSPで架橋。各種得られたsubunitの結合形態を解析	7)
	亜鉛トランスポーター(ZIP13タンパク)の生化学特性の解析 ZIP13タンパクを架橋し、homo-dimerの形で機能を有していることを確認	8)
	ApoA-1の脂質結合構造の解析 冠動脈疾患に対し効能の高いApoA-1を架橋し、質量分析により構造を解析	9)
	ユビキチンタンパクリガーゼ(TRIP12)の構造解析 ユビキチンに結合するTRIP12ドメインの解析に架橋剤としてDSPを使用	10)

 

1. Y. Nonaka, et al., "Crystal structure of a Xenopus laevis skin proto-type galectin, close to but distinct from galectin-1", Glycobiology, 2015, 25(7), 792.
2. M. Tan, et al., "The P Domain of Norovirus Capsid Protein Forms Dimer and Bind to Histo-Blood Group Antigen Receptor", J. Virol., 2004, 78(12), 6233.
3. B. X. Huang, et al., "Probing Three-Dimensional Structure of Bovine Serum Albumin by Chemical Cross-Linking and Mass Spectrometry", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2004,15, 1237.
4. T. Nuernberger, et al., "Covalent cross-linking of the Phytophthora megasperma oligopeptide elicitor to its receptor in parsley membranes", PNAS, 1995, 92, 2338.
5. Clerc A, et al., "Interaction between cGMP-phosphodiesterase and transducin alpha-subunit in retinal rods. A cross-linking study", J Biol. Chem., 1992, 267(28),19948.
6. Stanley E. D'Souza, et al., "Chemical Cross-linking of Arginyl-Glycyl-Aspartic Acid Peptides to an Adhesion Receptor on Platelets", J.Biological Chemistry, 1988, 263(8), 3943.
7. J. P. Aris, et al., "Cross-linking and Labeling of the Escherichia coli F₁F₀-ATP Synthase Reveal a Compact Hydrophilic Portion of F₀ Close to an F₁ Catalytic Subunit", J. Biol. Chem., 1983, 258(23), 14599.
8. Bum-Ho Bin, et al.,"Biochemical characterization of human ZIP13 protein: a homo-dimerized zinc transporter involved in the spondylocheiro dysplastic Ehlers-Danlos syndrome.", J Biol. Chem., 2011, 286(46), 40255.
9. Shaila Bhat, et al., "Intermolecular contact between globular N-terminal fold and C-terminal domain of ApoA-I stabilizes its lipidbound conformation: studies employing chemical cross-linking and mass spectrometry", J Biol. Chem., 2005, 280(38), 33015.
10. Yoon Park, et al., "The HECT domain of TRIP12 ubiquitinates substrates of the ubiquitin fusion degradation pathway.", J Biol. Chem., 2009, 284(3), 1540.

 

様々な架橋剤を用いたアプリケーションや取扱い説明書をご用意しています。

ご興味のある方は、小社ホームページ (www.dojindo.co.jp) にアクセス頂き、試薬パンフレットダウンロード 欄よりご確認ください。