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グルタチオン分別定量キット GSSG/GSH Quantification Kit

　グルタチオン(γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine)は生体内に存在するトリペプチドで、Glutathione Peroxidase、GlutathioneS-TransferaseおよびThiol Transferase等の酵素基質として抗酸化や薬物代謝などに関与しています。グルタチオンは通常、生体内で還元型（GSH）として存在しています。しかし、酸化ストレスなどの刺激によって還元型（GSH）から酸化型（GSSG）に変換されるため、GSHとGSSGの比率が酸化ストレスの指標として注目されています。小社では総グルタチオン量を定量するためのキットTotal Glutathione Quantification Kit（品コード：T419）を販売しておりますが、GSSGおよびGSHをそれぞれ定量したいという要望が数多く寄せられました。そこで、このたびGSHとGSSGを分別定量できるキットを開発致しました。本キットには、GSHを隠蔽するためのマスキング剤が含まれています。このマスキング剤をサンプルに添加することによって、サンプル内のGSHのみを隠蔽することができます。その後、酵素リサイクリング法を用いたDTNB（5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)）の発色（λ_max = 412 nm）を測定することによってGSSGのみを定量することができ、別途測定した総グルタチオン量からGSSG量を差し引くことでGSH量を求めることが可能です。なお総グルタチオンの測定範囲は0.5〜50μmol/l、GSSG の測定範囲は0.5〜25μmol/lとなっております。

　以下に赤血球中のGSSGおよびGSHを定量した例を示します。本キットを用いた測定の結果、赤血球中の総グルタチオン濃度433μmol/l(GSSG濃度23μmol/l,GSH濃度387μmol/l;GSSG/GSH=0.059)という値を得ることができました。一般的に赤血球中のGSSG量はGSHの数％程度であることが知られています。

＜赤血球中のGSSG ／ GSH 測定例＞

サンプルの前処理

1) 抗血液凝固剤を加えた血液を,1000xgで10分間4℃にて遠心した。

2) 上清を捨て、4 倍量の5% 5- スルホサリチル酸（SSA）で溶血した。

3)8,000xg で10分間 4℃にて遠心した後、上清を測定試料とした。

総グルタチオンの定量

1)0.5%SSAで10倍に希釈した測定試料およびGSH standard solution 40μlを各ウェルに添加した後、Buffer solution 120μlを各ウェルに添加した。

2)Substrate working solution 20μlを各ウェルに添加した後、Coenzyme working solution およびEnzyme workingsolution を20μlずつ各ウェルに添加した。

3)37℃で10分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて405nm吸光度を測定した。

　測定試料の405nm吸光度（実測値 1.397）から試料中の総グルタチオン濃度を検量線 (Fig.1) より求めた。その結果、総グルタチオン濃度は43.3μmol/l（原液の測定試料中は433μmol/l）であった。

酸化型グルタチオン（GSSG）の定量

1)0.5% SSAで10倍に希釈した測定試料およびGSSGstandard solution 200μlにMasking reagent 4μlを添加した後、40μlを各ウェルに添加した。

2)Buffer solution 120μlを各ウェルに添加した後、37℃で1時間インキュベートした。

3)Substrate working solution 20μlを各ウェルに添加した後、Coenzyme working solution およびEnzyme working solution を20μlずつ各ウェルに添加した。

4)37℃で10分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて405nm吸光度を測定した。

　測定試料の405nm吸光度（実測値 0.312）から試料中のGSSG 濃度を検量線 (Fig.2) より求めた。その結果、GSSG濃度は2.3μmol/l（原液の測定試料中は23μmol/l）であった。

還元型グルタチオン（GSH）の算出

下記の数式に当てはめてGSH濃度を算出した結果、GSH濃度は38.7μmol/l（原液の測定試料中は387μmol/l）であった。

GSH濃度 ＝ 総グルタチオン濃度 −（GSSG濃度x2）

※操作に必要な試薬類（5-スルホサリチル酸（SSA）、エタノールは除く）は、キットに含まれています

＜キット内容＞
Enzyme solution 50μl × 1本 　 Coenzyme 2本 　 Buffer solution 60ml × 1本 　 Substrate (DTNB) 4本 　 Standard GSH 1本 　 Standard GSSG 1本 　 Masking reagent 20μl × 1本

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