一分子DNAポリメラーゼによるリアルタイムDNAシーケンシング

株式会社 同仁化学研究所　江頭貴宏

　今日、ゲノム情報の解明が盛んに行われている。なかでも、ヒ トのゲノムの全塩基配列を解析するプロジェクトであるヒトゲノ ム計画（Human Genome Project）が、2003年に完了し、遺伝 子疾患の原因追究やその治療法開発だけでなく、ヒトの進化の歴 史の解明など、バイオ技術、生命科学に応用できることが期待さ れている。

　ゲノムの塩基配列を解析する手法としては、サンガー法やそ の改良法があり、これらはDNAポリメラーゼを利用したもので ある。サンガー法では低濃度の鎖停止ヌクレオチド(ターミネー ターと呼ばれる)などを使って読み取りを中断し、電気泳動など で分離して解析を行っている。従ってこの方法は、操作が煩雑で、 解析に時間がかかってしまう(図1)。

図1

　サンガー法の欠点を克服し、高速で大量にDNA配列分析を可 能にする次世代の方法が考えられている。

　その方法は、一分子のDNAポリメラーゼを使用し、DNA合 成中に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドをリアルタイムで検 出する方法¹⁾ や、ヌクレオチドがDNA合成中に取り込まれる時 に放出するピロリン酸をATPに変換し発光反応に用いることで、 DNA合成中に使われたヌクレオチドを定量するピロリン酸塩検 出法塩基延長法がある²⁾。また、化学的な識別とは全く異なる、 ヌクレオチドの各塩基を物理的に識別することによって配列を決 定するナノポア法がある³⁾。ナノポア法は半導体技術を応用した もので、一本鎖DNAを微小なSi酸化膜を通過させ、その時に流 れる電流を測定し塩基配列を解読する。この方法は操作が簡単で 安価であること、しかも、蛍光色素などの試薬を必要としないと いう大きなメリットを持つが、一分子の塩基を識別出来る解像度 が得られるかどうかが課題である。

　ここでは、次世代の塩基配列解析法の中で、特に一分子のDNAポリメラーゼを固定化し、リアルタイムでDNA合成を観察 する方法を紹介する。

　この方法はPacifi c Bioscience社が開発し、短時間でDNA配 列を読み取ることができ、読み取れる鎖長が従来法よりも長く、 ゲノムの解析の速度を大幅に増やすことができるようになると期 待されている(図2)。

　この方法の特徴は、それぞれ違う波長をもつ蛍光色素を塩基で はなく末端のリン酸につけた4種類のデオキシリボヌクレオシド 三リン酸（dNTPs）(図3)を使うことである。また、Zero-Mode Waveguide(ZMW)を開発し、鋳型DNAに従って連続的に合成を行う一分子のDNAポリメラーゼが、dNTPsを取り込む間の蛍光 のみ検出できるようになり、リアルタイムでDNA塩基配列の決 定に成功した。

図2

図3

　リアルタイムで複数のDNAポリメラーゼのDNA合成を一度 に検出すると、各々のDNAポリメラーゼの合成速度にバラツキ があるため正確な測定ができない。そのため、DNA合成を個別 に観察する必要がある。そこで、一分子のDNAポリメラーゼを 直径100nmのガラス基盤に独立に吸着させ、DNA合成の様子を 個別に観察した。

　DNAポリメラーゼを吸着させるガラス底面には、ビオチン化 したポリエチレン・グリコールを結合させ、DNAポリメラーゼ1分子のみを固定化した。また、側面への非特異吸着を抑えるた めに、側面のアルミニウム表面をポリリン酸で修飾している(図4)。

図4

　DNAポリメラーゼによるDNA合成を蛍光検出する場合は、蛍 光ラベルを持つヌクレオチドが必要になる。共焦点顕微鏡や全反 射顕微鏡法などの照射範囲が広いものを使うとDNA合成の活性 部位に取り込まれていない蛍光ラベルを持つヌクレオチドの蛍光 が観測されてしまいバックグラウンドが高くなるという問題点が ある。そのため、ZMWを使って狭い範囲を照射し、DNAポリメ ラーゼ一分子にしか光が届かないように設計されている。

　リアルタイムでのDNA配列の決定は以下のようにして行わ れる(図5)。鋳型一本鎖DNAの塩基に相補的な蛍光ラベルしたdNTPがDNAポリメラーゼにより取り込まれ、蛍光基もZMWの検出範囲内に入ってきて蛍光が検出される。DNA合成が終了 すると、蛍光ラベルしたリン酸ジエステル結合が外れて拡散し、 より蛍光基がZMWの検出範囲外に出ていくため、蛍光が検出さ れなくなる。次に、別の蛍光ラベルしたDNAの塩基に相補的なdNTPがDNAポリメラーゼにより取り込まれ、DNAが合成され る間、蛍光が検出され、DNA合成が終了し、蛍光ラベルしたリ ン酸ジエステル結合が外れると蛍光が検出されなくなる。この検 出を続けて、検出された蛍光波長の種類と順番により、DNAの 配列が決定される。

　図4に示した一分子のDNAポリメラーゼを固定したZMWを、 数千を集積して1枚のチップにすることが考えられている。この チップを用いると、数千の鋳型DNAのDNA配列を一度に観測 でき、多くのDNA解析ができる。

図5

　ここで紹介したDNAシーケンシング方法を使うことで、解析 スピードが増し、さらに一度に多種類のDNAを分析することで コストの低減にも繋がる。また、多くの解析データを蓄積するこ とができるようになる。その結果、ヒトの遺伝子と染色体の根本 的な構成がより明らかになり、一人一人にあわせたテイラーメイ ド医療を行なえるなど、治療や予防が画期的に進展することが期 待されている。

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参考文献

1) J. Eid, et al., Science, 2009, 323 , 133-138
2) Mostafa Ronaghi, et al., Anal. Biochem., 1996, 242 , 84-89.
3) S. Iqbal, D.Akin and R. Bashir, Nature Nanotechnology, 2007, April 2, 243.

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