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新製品
微生物検出キット（比色） Microbial Viability Assay Kit-WST

　福岡県工業技術センターとの共同開発により微生物の比色検出キットを開発、10月30日より発売を開始致しました。本製品は、水溶性テトラゾリウムであるWST-8（特許2757348）を発色試薬として用いた微生物の比色検出キットです。

＜特長＞
  • 寒天培地法や微量液体希釈法に比べ、短時間での検出が可能(Fig. 2-5 , Table 1)。
  • マイクロプレートを使った多検体処理が可能。
  • 培地成分による影響を受けにくい(Fig. 6)。

＜キット内容＞
500 tests/ 1 kit（96 wellプレート5枚分）
  • WST solution 1 ml × 5 tubes
  • Electron mediator reagent 0.5 ml × 1 tube

＜本キット以外に必要なもの＞
  • マイクロプレートリーダー（測定波長：450〜490 nm）
  • 96穴マイクロプレート
  • マイクロピペット及びチップ
  • 1.5ml チューブ
  • インキュベーター

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原理

　微生物はエネルギー代謝活動により細胞内にNAD(P)Hを生成します。
　WST-8は電子メディエーターを介する事で、このNAD(P)Hにより還元され、水溶性formazan（オレンジ色）を生成します(Fig. 1)。formazanの生成量は微生物のエネルギー代謝活性に比例するため、オレンジ色への呈色を見ることで、その微生物の生存率や活性度合を確認できます。

Fig.1
Fig. 1　発色原理

微生物増殖試験

　細菌（E.coli , S.aureus）懸濁培地を10倍希釈系列で96 well マイクロプレートに播種した。
各wellに発色試薬を添加し、37℃でインキュベートしながら一定時間ごとの吸光度（460 nm）をマイクロプレートリーダーにて測定した（Fig. 2, 4）。それぞれの菌体密度においてOD460が0.5に達した時間を求めると、菌体密度とOD460 =0.5到達時間との間に高い直線関係が得られた（Fig. 3, 5）。


Fig.2 Fig.3
Fig. 2　E.coli の発色曲線 Fig. 3　E.coli の菌体密度と発色時間
Fig.4 Fig.5
Fig. 4　S.aureus の発色曲線 Fig. 5　S.aureus の菌体密度と発色時間

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薬剤感受性試験

　各細菌を抗生物質を含むMueller-Hinton培地中で6時間（35℃）インキュベートした後、発色試薬を添加し2時間（35℃）反応させた。各薬剤濃度において、発色が確認されなかった濃度を同キットにおけるMinimum Inhibitory Concentration(MIC)とした。 Microdilution method（日本化学療法学会標準法）では22時間のインキュベーション後に目視でMICを求めるが、本キットを用いた場合、8時間でMicrodilution methodと同等のMIC(μg/ml)を得ることができた。

Table 1　Microbial Viability Assay Kit-WSTとMicrodilution methodでのMIC値の比較
Table 1


薬剤感受性試験の手順

  1. 微生物を最適な培地で培養する。
  2. 培養した菌懸濁液を滅菌生理食塩水で OD550 が約 0.125 （0.5 McFarland相当）となるように希釈し、さらに滅菌生理食塩水で10倍希釈し接種用菌液とする（約107 CFU/ml）。
  3. 抗生物質などの被検物質をCa及びMgイオン濃度調整済み Muller-Hinton broth を用いて 2 倍希釈系列に調製する。（例えば、64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.12, 0.06 μg/ml）
  4. 96wellプレートへ抗生物質含有 Muller-Hinton broth 180 μl/wellを分注する。
  5. 各wellへ接種用菌液10 μlを分注する（約104 CFU/well）。
  6. 微生物に適した温度で 6 時間インキュベーションする。
  7. WST solution と Electron mediator reagent を 9 ： 1 で混合し、検出試薬とする。
  8. 6 時間 インキュベーションしたマイクロプレートに、手順 7)で作成した検出試薬を10 μl/well添加し、更に、2時間インキュベーションする。
  9. マイクロプレートリーダーにて450〜490 nmの吸光度を測定する。

＊グラム陽性菌や真菌を検体とされる場合は、Electron mediator reagent を滅菌水もしくはDMSOにて8倍希釈したもので、検出試薬の調製を行って下さい。
＊必ずブランクを測定して下さい（菌を含まない抗生物質含有培地）。


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培地成分の影響を受けにくい

　微生物の培養には各種培地が使用され、その成分も様々です。よって、これら培地成分による非特異的な発色（還元反応）が起こりにくいという事が検出試薬にとって重要なポイントです。Microbial Viability Assay Kit-WSTで採用しているWST-8は、培地成分による還元を殆ど受けませんので、より比色検出に適したテトラゾリウム化合物です。


Fig.6
Fig. 6　培地成分によるバックグランドへの影響
培地成分を含むPBS（pH 7.0）に検出試薬を加え、37℃にて24時間インキュベートし吸光度を測定した。
〈測定波長〉WST-8 formazan 460 nm


品名 容量 価格(￥) メーカーコード
Microbial Viability Assay Kit-WST 500 tests 20,000 M439

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